RAZMAZIVANJE BAKTERIJA: KARAKTERISTIKE I PRIPREMA - BIOLOGIJA - 2025

Bakterijski premazati je tanki film mrlja suspenzije mikroorganizama koja je napravljena na prozirnoj staklene ploče ili klizača za promatranje pod svjetlosnim mikroskopom.

Produljenje u obliku filma provodi se kako bi se mikroorganizmi razdvojili što je više moguće, jer ako su oni grupirani, promatranje nije jasno.

Slika 1. Bakterijski bris uočen pod skenirajućim elektronskim mikroskopom. Izvor: pixbay.com

U istraživanju bakterijskih kultura koriste se tehnike pripreme, fiksacije i bojenja kako bi se bolje analizirale. Zbog male veličine mikroorganizama, za njihovo promatranje nužna je upotreba optičkog mikroskopa.

Optički mikroskopi su važni instrumenti za promatranje razmaza. Tu se koriste optička sočiva i svjetlost koji omogućuju pregled uzoraka s velikim uvećanjem.

Općenito, žive stanice nemaju uglavnom obojene strukture, gledano svjetlosnim mikroskopom to su bezbojni, prozirni uzorci, a pokazuju vrlo malo unutarnjeg kontrasta i s njihovim okruženjem.

Promatranje pomoću jednostavnog mikroskopa svjetlosnog polja, bez korištenja pomoćnih tehnika bojenja, vrlo je ograničeno i koristi se samo u nekim slučajevima, poput promatranja kretanja mikroorganizama.

Za optimalno promatranje mikroorganizama mora se uspostaviti ravnoteža između kontrasta i razlučivosti. Pojedinosti o stanici ne mogu se vidjeti pod mikroskopom, čak ni pri visokoj razlučivosti; Upotreba boja potrebna je pomoću tehnika bojenja, koje pružaju kontrast za promatranje.

Karakteristike kvalitetnog bakterijskog razmaza

Izvrstan kontrast

Za postizanje izvrsnog kontrasta postoje sofisticirani mikroskopi koji se nazivaju fazni kontrastni mikroskopi, diferencijalni interferencijski mikroskopi i mikroskopi s tamnim poljem. Ova se vrsta mikroskopa koristi, među ostalim, za promatranje bakterijskih struktura poput omotača i niti.

Bojenje je jednostavna tehnika povećavanja kontrasta koja se postiže svjetlosnim mikroskopom. U ovoj se tehnici mogu koristiti različite mrlje, koje značajno poboljšavaju mikroskopsko promatranje.

Mrlje se provode izravno na mrljama ili ekstenzijama suspenzija mikroorganizama na stakalcima, prethodno osušenim i fiksiranim.

Dobro popraviti

Fiksacija je tehnika koja se koristi za očuvanje staničnih struktura; izaziva inaktiviranje mikroorganizama i adheziju na staklu tobogana. Postoje različiti tretmani fiksiranja: fiksacija topline i kemijska fiksacija.

Fiksacija topline

Ovo je najčešće korištena metoda promatranja razmaza bakterija. Tehnika se sastoji od prolaska bakterijske suspenzije razmaza kroz plamen upaljača. Ova tehnika je u stanju sačuvati vanjsku morfologiju bakterija, ali uništava njihove unutarnje strukture.

Kemijska fiksacija

Za kemijsko fiksiranje između ostalog koriste se kemikalije za očuvanje, poput formaldehida ili formalina, etanola i octene kiseline. Prednost upotrebe kemijskih sredstava za učvršćivanje je u tome što se postiže očuvanje unutarnjih staničnih struktura mikroorganizama.

Slika 2. Krv krvi. Izvor: Bobjgalindo, iz Wikimedia Commons

Dobra boja

Najčešći postupci bojenja prethodno osušenog i fiksiranog mrlja su pozitivno ili jednostavno obojenje, diferencijalno bojanje i negativno bojenje. Postoje i posebne tehnike bojenja određenih staničnih struktura (kapsula, spore, flagele).

Pozitivno bojenje ili jednostavno bojenje

Pozitivno ili jednostavno bojenje je najčešće korištena tehnika bojenja razmaza. Koristi boje koje se mogu vezati za određene mikrobne strukture, omogućujući im promatranje pod mikroskopom.

Ove boje imaju u svojoj kemijskoj strukturi kromoforne skupine (obojeni dio), s naizmjeničnim dvostrukim vezama i jednostrukim vezama (konjugacijom). Ove veze zauzvrat mogu uspostaviti ionske ili kovalentne veze s nekim staničnim strukturama.

Boje koje se koriste kod pozitivnog ili jednostavnog bojenja su uglavnom kemijski derivati ​​anilina (obojene organske soli).

S druge strane, među bojama možemo pronaći neke s bazičnim pH, a druge s kiselim pH.

Osnovna bojila

U osnovnim bojama, kromoforska skupina ima pozitivan električni naboj. Velika većina prokariotskih mikroorganizama ima neutralni unutarnji pH, a njihova stanična površina negativno je nabijena. Kroz ovu elektrostatičku interakciju, kromofor se veže za stanicu i obojava je.

Primjeri osnovnih boja su metilen plava, kristalno ljubičasta, malahit zelena, bazični fuscin, safranin, između ostalih.

Kisele boje

U kiselim bojama, kromoforska skupina ima negativan električni naboj. Koriste se za bojenje proteina pozitivno nabijenih amino skupina. Primjeri kiselih boja su kiseli fuscin, ružičasti bengal, crveni Kongo i eozin.

Diferencijalno obojenje

Tehnika diferencijalnog bojenja sastoji se u nanošenju dvije boje različite boje ili intenziteta, radi razlikovanja različitih mikroorganizama pod mikroskopom. Mrlje po Gramu i mrlja otpornost na kiselinu i alkohol najčešće su različite bakterije u bakteriologiji.

Mrlja po Gramu koristi se kao preliminarni test za poznavanje oblika, veličine, grupiranja stanica, kao i vrste stanične stijenke. Korištenjem Gram testa na mrlje, bakterije stanične stijenke klasificiraju se u gram-pozitivne bakterije i gram-negativne bakterije.

Negativno bojenje

U ovoj se tehnici koriste kemijska bojila koja ne prodiru u unutrašnjost stanice, ali čine medij u kojem se mikroorganizmi pojavljuju kao crna pozadina.

U tehnici negativnog bojanja, razmaz se stvara od kapi indijske suspenzije ili suspenzije nigrosina, koja nakon omogućavanja sušenja na sobnoj temperaturi tvori neproziran film za prolazak svjetlosti. Na taj se način mikroorganizmi pojavljuju kao svijetli oblici na tamnoj pozadini.

priprema

A. Smrad

1.- Klizače vrlo dobro operite, osušite upijajućim papirom i označite ih. Etiketa mora sadržavati sadržaj pripravka, datum i ime osobe koja ga je obradila.

2.- Upalite upaljač i sterilizirajte petlju za inokulaciju u plamenu do svijetlo crvene boje.

3.- Ostavite da se ručka ohladi.

4.- Uzmite epruvetu s bakterijskom kulturom, uklonite poklopac i brzo prođite usnicu epruvete u blizini plamena plamenika (plamen).

5.- Umetnite inokulacijsku petlju u epruvetu s bakterijskom kulturom i uzmite uzorak.

6. - Ako je kultura u tekućem mediju, uzorak uzet ručkom stavite u sredinu tobogana i pažljivo ga razmažite u krug promjera oko 2 cm.

7.- Ponovno sterilizirajte petlju za inokulaciju.

8.- Ostavite da se suha suši na zraku.

9.- Ponovite korake 3 do 8 tri puta.

10. - Ako je kultura u čvrstom mediju, na tobogan se prethodno mora staviti kap destilirane vode. To je učinjeno tako da se pomiješa mali uzorak kulture uzet u inokulacijsku petlju, prema uputama u koracima 2 do 5 (aseptični uvjeti).

11.- Razrijedite razrijeđeni uzorak s kapljicom vode na klizaču i ponovite tri puta.

B. Fiksacija

1. - Dodajte dvije kapi metanola ili apsolutnog etanola suhim mrljama - iz kultura u tekućem mediju -.

2. - Omogućite sušenje zraka dalje od upaljača.

3. - Ako mrlja dolazi iz kulture u krutom mediju, suhi se razmaz fiksira toplinom, prolazeći ga 2 do 3 puta brzo kroz najtopliji dio upaljača.

4.- Dotaknite donji dio mrlje dorzalnim dijelom lijeve ruke (za desničare; u suprotnom koristite desnu ruku) i provjerite je li hladno.

C. Jednostavno bojenje

1.- U masu dodajte 2 kapi odabrane mrlje i ostavite da djeluje u vremenu koje je potrebno za posebne mrlje za svaku mrlju (uglavnom između 1 i 5 minuta).

2. - Neke mrlje zahtijevaju korištenje topline za njihovo aktiviranje; u tom slučaju morate biti vrlo oprezni pri zagrijavanju tobogana u upaljaču (manipulirajte pincetom i izbjegavajte ključanje). Pregrijavanje razmaza može uništiti stanice koje se promatraju.

3.- Uklonite višak bojila ispiranjem destiliranom vodom iz piketa. Vodu za pranje uklonite laganim dodirivanjem klizača po njenom rubu, nagnutim na radnom stolu.

4.- Omogućite sušenje zraka.

5.- Ovisno o vrsti promatranja, u ovoj se fazi koristi pokrivač ili ne. Pokrivač štiti i čuva razmaz. Ako se u ovoj fazi vrši promatranje uranjanja ulja, ne koriste se pokrovni poklopci, ali mrlja se ne može sačuvati.

D. Definitivno očuvanje razmaza

1. - Umazati sukcere sukcesivno u svaku od niže navedenih otopina, u trajanju od najmanje 5 minuta. Svrha ovih "kupki" je potpuno dehidriranje razmaza. Svaki reagens treba temeljno isušiti prije nego što se ubrizgava u sljedeću kupku.

Redoslijed kupki za dehidraciju je sljedeći:

1. Etanol 70%
2. Etanol 95%
3. Čisti aceton
4. Smjesa aceton-ciklol 1: 1
5. Ksilol

Zatim pustite da se osuši na zraku.

2. Montirajte pokrivač, po mogućnosti 22 × 22 mm, koristeći kanadski balzam ili drugi materijal za ugradnju.

Reference

1. Briggs, G. (1965). Čimbenici uzroka mikrobioloških laboratorijskih nesreća i infekcija. Biološke laboratorije američke vojske. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG i Welch, CT (2017). Mikrobiologija: Laboratorijski priručnik. Pearson.
3. Holt, urednik JG-a. (1977). Kraći Bergeyev priručnik o odlučujućoj bakteriologiji. 8. ^th Baltimore: Williams and Wilkins Co.
4. Johnson, TR i Case; CL (2018). Laboratorijski eksperimenti u mikrobiologiji. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Dijagnostička mikrobiologija. 14 ^-og St. Louis, USA: Elsiever, Inc.