IMUNOFLUORESCENCIJA: OBRAZLOŽENJE, PROTOKOL I PRIMJENE - BIOLOGIJA - 2025

Imunofluorescencija je snažan tehnika imunohistokemijskom metodom antitijela kovalentno vezan za fluorescentne molekule prepoznati specifične ciljeve u uzorcima stanica fiksni na čvrstu podlogu.

Ova tehnika uključuje mikroskopsko promatranje s imunološkom specifičnošću, što omogućuje promatranje živih ili mrtvih stanica koje mogu predstavljati neznatne količine antigena. Široko se koristi kako u području istraživanja, tako i u kliničkoj dijagnozi različitih patologija.

Imunobilježavanje aktinskih filamenata u stanicama kardiomiocita (Izvor: Ps1415 putem Wikimedia Commonsa)

Ova tehnika, uglavnom kvalitativna (s nekim kvantitativnim varijantama), odnosi se posebno na vizualizaciju uzorka fluorescentnim signalom proizvoda, koji je fluorescentna molekula vezana na antitijelo i koja se može pobuđivati ​​na određenoj valnoj duljini.,

U staničnoj vezi vrlo je korisno proučiti prisutnost / odsutnost i subcelularno mjesto proteina. Tehnika se u početku koristila u kliničkom okruženju za dijagnozu virusa poput gripe, a potom i za mnoge druge zarazne bolesti.

To je vrlo osjetljiva tehnika i s odgovarajućom opremom za mikroskopiju može imati vrlo dobru razlučivost. Za njegovo promatranje zahtijeva korištenje mikroskopa konfokalnih ili epifluorescentnih.

No, iako je vrlo popularan, može predstavljati neke važne probleme u vezi s dobivanjem nespecifične fluorescencije koja stvara pozadinski "šum", što često ograničava adekvatno očitavanje rezultata.

osnova

Imunofluorescencija se temelji na iskorištavanju biološkog fenomena reakcije interakcije između antitijela i antigena. To se posebno odnosi na vizualizaciju ili otkrivanje ove reakcije uzbudljivim fluorescentnim molekulama do određene valne duljine.

Antitijelo je protein imunoglobulina koji se izlučuje iz aktivnih B stanica, a koji se specifično stvara protiv antigena, na koji se može vezati s visokim afinitetom i specifičnošću. Imunofluorescencija koristi IgG imunoglobuline koji su topljivi u krvnom serumu.

Antitijela su molekule do 950 kDa sastavljene od dva kratka (laka) i dva dugačka "teška" Y (u obliku) teška peptidna lanca. Laki i teški lanac podijeljeni su u dvije domene: jedna varijabilna sposobna prepoznati antigen, a druga stalna ili očuvana karakteristična za svaku vrstu.

Antigeni su funkcionalno definirani kao molekule koje se antitijelom mogu prepoznati i većinom su proteini. Kada je životinja izložena antigenu, aktiviraju se limfociti imunološkog sustava, proizvodeći specifična antitijela protiv njega i ona djeluju kao obrambeni sustav.

Antigen, kao što je protein, na primjer, može imati više epitopa ili mjesto prepoznavanja antitijelom, tako da serum životinje izložen antigenu može imati poliklonalna antitijela protiv različitih regija istog proteina.

Imunofluorescencija, dakle, iskorištava sposobnost životinje da proizvodi poliklonalna antitijela protiv određenog antigena kako bi ga pročistila i potom koristila za otkrivanje istog antigena u drugim kontekstima.

Među fluorescentnim bojama ili molekulama koje se najčešće koriste u nekim imunofluorescentnim tehnikama su fluoresceinski izotiocijanat (FITC), tetrametil-rodamin izotiocijanat-5 i 6 (TRITC), mnogi cijanini poput Cy2, Cy3, Cy5 i Cy7 i boje nazvane Alexa Fluor®, kao što je Alexa Fluor®448.

Protokol

Imunofluorescentni protokol varira ovisno o mnogim čimbenicima, međutim, općenito rečeno, obuhvaća linearni slijed koraka koji se sastoji od:

• Priprema ploča i stanica
• Fiksacija uzoraka
• Pcrmcabilizacija
• Blokiranje
• Imunostanje ili imuno obojenje
• Montaža i promatranje

-Preparation

Od uzoraka

Priprema uzoraka ovisit će o njihovoj prirodi i vrsti iskustva koje treba provesti. Najjednostavniji slučaj, koji uključuje upotrebu stanica u suspenziji, bit će objašnjen u nastavku.

Stanice u suspenziji, to jest u tekućem mediju za kulturu, prvo se moraju odvojiti od nje centrifugiranjem, a zatim moraju biti isprane s puferskom otopinom ili izosmotskim "puferom", čime se zadržava njihova cjelovitost.

Obično se koristi fosfat-fiziološki pufer poznat kao PBS, u kojem se stanice ponovo suspendiraju i ta se smjesa ponovno centrifugira, čime se dobivaju stanice bez kultivacijskog medija, koje mogu sadržavati ometajuće tvari.

Od lopatica

Klizači koji se koriste za mikroskopsko promatranje, gdje će se stanice kasnije fiksirati za odgovarajuće tretmane nizvodno, također se moraju pažljivo pripremiti.

Oni su prekriveni ili „osjetljivi“ na otopinu poli-lizina, sintetičkog polimera koji će djelovati kao „molekularno ljepilo“ između stanica i čvrstog nosača, zahvaljujući elektrostatičkoj interakciji između pozitivnih naboja njihovih amino skupina i negativni naboji proteina koji prekrivaju stanice.

Fiksacija uzoraka

Ovaj se postupak sastoji od imobilizacije proteina koji se nalaze unutar stanice kako bi se zadržala njihova netaknuta prostorna lokacija. Korištene molekule moraju biti sposobne križati sve vrste staničnih membrana i stvarati rešetke s kovalentnim proteinima.

Rasprostranjeni su formalmaldehid i paraformaldehid, glutaraldehid, pa čak i metanol, s kojima se uzorci stanica inkubiraju određeno vrijeme, a zatim se isperu s izosmotskom otopinom pufera.

Nakon fiksiranja stanica nastavljaju se pričvršćivati ​​na listove prethodno osjetljive na poli-lizin.

Pcrmcabilizacija

Ovisno o vrsti ispitivanja koja se provodi, bit će potrebno permeabilizirati ispitivane stanice ili ne. Ako se traži znati mjesto, prisutnost ili odsutnost određenog proteina na staničnoj površini, permeabilizacija neće biti potrebna.

S druge strane, ako želite znati položaj proteina unutar stanice, permeabilizacija je nužna i sastojat će se od inkubacije uzoraka s Triton X-100, deterdžentom sposobnim prožimanjem staničnih membrana.

Blokiranje

Temeljni korak u svim imunološkim tehnikama je blokiranje. U ovoj fazi postupka, blokiranje se sastoji od prekrivanja, na osjetljivim listovima, svih mjesta s molekulama poli-lizina na koje se stanice nisu lijepile. Odnosno, sprječava bilo kakvu nespecifičnu povezanost.

Za blokiranje rabe otopine s goveđim serumskim albuminom (BSA) u PBS puferu obično se koriste, a najbolji se rezultati dobivaju što je dulje vrijeme inkubacije s ovom otopinom. Nakon svakog koraka, uključujući blokiranje, potrebno je isprati preostalu otopinu.

Imunostanje ili imuno obojenje

Postupak imunološkog bojenja ili imunološke boje ovisit će uglavnom o tome je li izravna ili neizravna imunofluorescencija (vidjeti dolje).

Ako je primarna ili izravna imunofluorescencija, uzorci će se inkubirati s željenim antitijelima koja se moraju povezati s fluorescentnim bojama. Postupak inkubacije sastoji se od razrjeđivanja antitijela u otopini koja će također sadržavati BSA, ali u manjem udjelu.

Ako je slučaj sekundarne ili neizravne imunofluorescencije, potrebno je provesti dvije uzastopne inkubacije. Prvo s željenim antitijelima, a zatim s antitijelima koja mogu detektirati konstantna područja primarnih imunoglobulina. Upravo su ta sekundarna antitijela kovalentno vezana na fluorofore.

Tehnika je vrlo svestrana, omogućava istovremeno označavanje više antigena po uzorku, sve dok postoje primarna antitijela povezana s različitim fluoroforama, u slučaju izravne imunofluorescencije.

Za istovremeno označavanje u indirektnoj imunofluorescenciji, potrebno je osigurati da se svako primarno antitijelo proizvede u drugoj životinji, kao i da je svako sekundarno antitijelo povezano s različitim fluoroforom.

Poput blokade, inkubacija s antitijelima daje bolje rezultate što duže traje. Nakon svakog koraka potrebno je isprati višak antitijela koji se nisu vezali za uzorke, a u sekundarnoj imunofluorescenciji potrebno je blokirati prije dodavanja sekundarnog antitijela.

Određene tehnike koriste druge mrlje koje nisu povezane s imunološkim bojenjem, poput bojenja nuklearne DNK fluoroforom DAPI.

Montaža i promatranje

Tijekom završnog vremena inkubacije s fluoroforima potrebno je da uzorci ostanu u mraku. Za promatranje pod mikroskopom uobičajeno je koristiti neke tvari za očuvanje fluorescencije fluorofora zajedno s antitijelima.

vrste

Grafički sažetak izravne i neizravne imunofluorescencije (Izvor: Westhayl618 putem Wikimedia Commons)

Izravna ili primarna imunofluorescencija

To ima veze s otkrivanjem antigena primjenom fluorescentnih antitijela. Glavna prednost korištenja ove tehnike je njezina brzina, međutim, u tom se procesu mogu pojaviti mnogi slučajevi nespecifičnog vezanja, posebno pri proučavanju humanih seruma, jer su oni bogata visoko heterogenim antitijelima.

Indirektna ili sekundarna imunofluorescencija

Poznata je i kao tehnika "sendviča", a to uključuje razvoj tehnike u dva koraka. Prvo se odnosi na upotrebu ne-fluorescentnog antitijela i njegovo vezanje na antigen koji nas zanima.

Protiv konstantnog područja ovog prvog antitijela (koje će sada služiti kao antigen) koristi se drugo antitijelo koje ga može prepoznati, koje je povezano s fluorescentnom molekulom.

Pojava fluorescentnog signala bit će rezultat specifičnog prepoznavanja između prvog nefluorescentnog antitijela i zanimanja antigena; prisutnost ovog prvog antitijela uvjetuje onog drugog, koje je označeno i zahvaljujući kojem se može utvrditi prisutnost ili odsutnost antigena.

Unatoč tome što je mnogo duža tehnika nego izravna imunofluorescencija (budući da uključuje još jedan korak inkubacije), ova tehnika ne uključuje dizajn fluorescentnog antitijela za svaki proučeni antigen, što rezultira u ekonomskom smislu, održiviji.

Nadalje, to je osjetljivija tehnika u smislu pojačanja signala, jer se više od jednog sekundarnog antitijela može vezati za konstantno područje primarnog antitijela, pojačavajući tako intenzitet fluorescentnog signala.

Prijave

Kao što smo već primijetili, imunofluorescencija je izuzetno svestrana tehnika koja se na brojne načine koristi u znanstvenim i kliničkim oblastima. Može se koristiti za odgovor na ekološka, ​​genetska i fiziološka pitanja koja se tiču ​​mnogih organizama.

Među kliničkim se primjenama koristi za izravnu dijagnozu nekih dermatoloških bolesti, bilo pomoću izravne ili neizravne imunofluorescencije na epitelnom tkivu ispitivanih pacijenata.

Tehnike imunofluorescencije bile su dostupne u jednoćelijskim organizmima poput kvasca za vizualizaciju intranuklearnih i citoplazmatskih mikrotubula, aktina i pridruženih proteina, 10 nm filamenata i drugih sastojaka citoplazme, membrane i staničnih zidova.

Reference

1. Abcam, imunocitokemija i protokol imunofluorescencije. Preuzeto s abcam.com
2. Greph, C. (2012). Fluorescentne boje. Preuzeto s leica-microsystems.com
3. Miller, DM, i Shakest, DC (1995). Imunofluorescentna mikroskopija. U metodama stanične biologije (svezak 48, str. 365–394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID i Cook, D. (2013). Imunofluorescentne tehnike. Časopis za istraživačku dermatologiju, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Imunofluorescentne metode za kvas. In Enzymology Methods (Vol. 194, str. 565–602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). Primjene imunofluorescencije u javnozdravstvenoj virologiji. Bakteriološki pregledi, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG i Anderson, DM (1996). Imunofluorescencija u istraživanju fitoplanktona: primjene i potencijal. J: Phycol., 32, 1–16.