CITOKEMIJA: POVIJEST, PREDMET PROUČAVANJA, KORISNOST I TEHNIKE - BIOLOGIJA - 2025

Citokemija sadrži niz tehnika koje se temelje na identifikaciju i rasporedu specifičnih tvari unutar stanice. Smatra se granom stanične biologije koja kombinira staničnu morfologiju i kemijsku strukturu.

Prema Bensleyu, utemeljitelju primjene moderne citologije, izražava da je svrha citokemije otkrivanje kemijske organizacije stanica kako bi se razumjele misterije života. Kao i proučavanje dinamičkih promjena koje se događaju tijekom različitih funkcionalnih faza.

1: Pagetova izvanredna bolest. (Hematoksilin-Eozin) 2: senilni plakovi opaženi u moždanoj kore kod pacijenta koji boluje od Alzheimerove bolesti. (Srebrna impregnacija) 3: zečji jezik, kolagena vlakna (plava). Mišićna vlakna (ljubičaste pruge). (Masson-ov trikrom). 4: Tkivo jetre s masnom degeneracijom. (Sudan III) 5: Upala jetre. Nekroza. (Toluidin plava) Izvori: Wikipedia. com / Korisnik: KGH / Datoteke javnih domena / Mohit Lalwani

Na taj je način moguće odrediti metaboličku ulogu koju ove tvari igraju u stanici.

Citokemija koristi dvije glavne metode. Prvi se temelji na kemijskim i fizikalnim postupcima. Ove tehnike pribjegavaju korištenju mikroskopa kao neophodnog instrumenta za vizualizaciju kemijskih reakcija koje se događaju na određene tvari unutar stanice.

Primjer: upotreba citokemijskih boja, poput Feulgen-ove ili PAS-ove reakcije, između ostalih.

Druga metoda temelji se na biokemiji i mikrokemiji. Ovom metodologijom moguće je kvantitativno odrediti prisutnost unutarćelijskih kemikalija.

Među tvarima koje se mogu otkriti u tkivu ili staničnoj strukturi jesu: proteini, nukleinske kiseline, polisaharidi i lipidi.

Povijest citokemije

Citokemijske tehnike od njihovog izuma pomogle su razumjeti sastav stanica, a s vremenom su se pojavile različite tehnike koje koriste različite vrste boja s različitim afinitetima i osnovama.

Nakon toga, citokemija je otvorila nove horizonte upotrebom određenih supstrata kako bi kolorimetrijski pokazao prisutnost enzima ili drugih molekula unutar stanice.

Isto tako, pojavile su se i druge tehnike poput imunocitohemije koja je bila od velike pomoći u dijagnostici mnogih bolesti. Imunocitokemija se temelji na reakcijama antigen-antitijelo.

S druge strane, citohemija je također koristila fluorescentne tvari nazvane fluorokromi, koje su izvrsni markeri za otkrivanje određenih staničnih struktura. Zbog karakteristika fluorokroma, on ističe strukture na koje je bio pričvršćen.

Što studiraš?

Različite citokemijske tehnike korištene na biološkom uzorku imaju nešto zajedničko: otkrivaju prisutnost određene vrste tvari i znaju njihov položaj unutar ocjenjivačke biološke strukture, bilo da je to stanični tip ili tkivo.

Te tvari mogu biti enzimi, teški metali, lipidi, glikogen i definirane kemijske skupine (aldehidi, tirozin itd.).

Podaci pruženi ovim tehnikama mogu pružiti smjernice ne samo za identifikaciju stanica, već i za dijagnozu različitih patologija.

Na primjer, citokemijske mrlje vrlo su korisne u razlikovanju različitih vrsta leukemije, jer neke stanice izražavaju određene enzime ili ključne tvari, a druge ne.

S druge strane, potrebno je napomenuti da bi, kako bi se mogla koristiti citohemija, trebalo uzeti u obzir sljedeća pitanja:

1) Tvar se mora imobilizirati na mjestu gdje se prirodno nalazi.

2) Tvar se mora prepoznati pomoću supstrata koji specifično reagiraju s njom, a ne s drugim spojevima.

Korisnost

Uzorci koji se mogu proučiti citokemijskim tehnikama su:

- Proširena periferna krv.

- Proširena koštana srž.

- tkiva fiksirana za histokemijske tehnike.

- Stanice fiksirane citocentrifugiranjem.

Citokemijske tehnike su od velike potpore u području hematologije, jer se široko koriste kako bi se pomoglo u dijagnostici i diferencijaciji nekih vrsta leukemije.

Na primjer: Esterazne reakcije koriste se za razlikovanje mijelomonocitne leukemije od akutne monocitne leukemije.

Razmazi koštane srži i periferne krvi kod ovih bolesnika su slični, jer je neke stanice morfološki teško identificirati. Za to se provodi esteraza test.

U prvom su specifične esteraze pozitivne, dok su u drugom nespecifične esteraze pozitivne.

Također su vrlo korisni u histologiji, jer, na primjer, upotrebom tehnike bojenja teškim metalima (impregnacija srebrom) mrlje se retikularna vlakna intenzivne smeđe boje u tkivu miokarda.

Tehnike citokemije

U nastavku ćemo objasniti najčešće korištene tehnike:

- Upotreba boja

Boje koje se upotrebljavaju u citokemijskim tehnikama vrlo su raznolike i mogu se razvrstati u skladu s nekoliko stajališta:

Prema radikalu prema kojem imaju afinitet

Podijeljeni su na: kiseli, bazični ili neutralni. Oni su najjednostavniji i najčešće korišteni u povijesti, koji nam omogućuju razlikovanje bazofilnih komponenata od acidofilnih. Primjer: obojenje hematoksilinom-eozinom.

U ovom slučaju jezgre stanica oboje u plavo (uzimaju hematokslin, što je osnovna mrlja), a citoplazme, crvene (uzimaju eozin, što je kiselina mrlja).

Prema boji koju daju

Mogu biti ortohromatski ili metahromatski. Ortohromatika je ona koja obojava strukture iste boje kao boja. Na primjer, slučaj eozina, čija je boja crvena, a mrlje crvena.

S druge strane, metahromatika oboja strukture različite boje od njihove, kao što je, na primjer, toluidin, čija je boja plava, a opet ljubičasta ljubičasta.

Vitalne ili supravitalne boje

Oni su bezopasne boje, odnosno obojavaju stanice i ostaju žive. Te se mrlje nazivaju vitalnim (npr. Tripano plavo za mrljanje makrofaga) ili supravitalnim (npr. Janus zeleno za mrlje mitohondrije ili neutralno crveno za bojenje lizosoma).

- Detekcija lipida pomoću boja topivih u masti

Osmij tetroksid

Boje lipide (nezasićene masne kiseline) crne boje. Ova se reakcija može promatrati svjetlosnim mikroskopom, ali budući da je ova boja visoke gustoće, ona se također može vizualizirati elektronskim mikroskopom.

Sudan III

Jedna je od najkorištenijih. Ova se boja difundira i otapa u tkivima, nakupljajući se u kapljicama lipida. Boja je grimizno crvena.

Sudanska crna mrlja B

Stvara bolji kontrast od prethodnog jer se može otapati i u fosfolipidima i kolesterolu. Korisno je za otkrivanje azurofilnih i specifičnih granula zrelih granulocita i njihovih prekursora. Stoga identificira mijeloidne leukemije.

- Bojenje aldehidnim skupinama (Schiffova mrlja periodične kiseline)

Schiffova mrlja periodične kiseline može otkriti tri vrste aldehidnih skupina. Oni su:

- Slobodni aldehidi, prirodno prisutni u tkivima (reakcija u plazmi).

- Aldehidi dobiveni selektivnom oksidacijom (PAS reakcija).

- Aldehidi dobiveni selektivnom hidrolizom (Feulgenska reakcija).

PAS reakcija

Bojenje se temelji na otkrivanju određenih vrsta ugljikohidrata, poput glikogena. Periodna kiselina Schiff prekida CC veze ugljikohidrata uslijed oksidacije glikolnih skupina 1-2, uspijevajući oslobađati aldehidne skupine.

Slobodne aldehidne skupine reagiraju sa Schiffovim reagensom i tvore ljubičasto-crveni spoj. Pojava ljubičasto-crvene boje pokazuje pozitivnu reakciju.

Ovaj test je pozitivan u biljnim stanicama, otkrivajući škrob, celulozu, hemicelulozu i peptine. Dok u životinjskim stanicama otkriva mucine, mukoproteine, hijaluronsku kiselinu i hitin.

Nadalje, koristan je u dijagnostici limfoblastične leukemije ili eritroleukemije, između ostalih patologija mijelodisplastičnog tipa.

U slučaju kiselih ugljikohidrata može se koristiti alcijansko plava mrlja. Test je pozitivan ako se primijeti svijetlo plava / tirkizna boja.

Reakcija plazme

Reakcija u plazmi otkriva prisutnost određenih alifatičkih aldehida dugog lanca poput palmi i stearala. Ova se tehnika primjenjuje na smrznutim histološkim dijelovima. Tretira se izravno s Schiffovim reagensom.

Feulgenska reakcija

Ova tehnika otkriva prisutnost DNK. Tehnika se sastoji u podvrgavanju fiksiranog tkiva hidrolizi slabe kiseline da bi se kasnije reagiralo sa Schiffovim reagensom.

Hidrolizom se izlaže deoksiriboza aldehidne skupine na deoksiriboza-purinskoj vezi. Schiffov reagens tada reagira s aldehidnim skupinama koje su ostale slobodne.

Ova reakcija je pozitivna u jezgrama, a negativna u citoplazmi stanica. Pozitivnost dokazuje prisutnost crvene boje.

Ako se ova tehnika kombinira s metil-zelenim-pironinom, moguće je istovremeno detektirati DNA i RNA.

- Citokemijske mrlje za proteinske strukture

Za to se može upotrijebiti Millonova reakcija koja kao žila koristi živin nitrat. Strukture koje sadrže aromatske aminokiseline postat će crveno obojene.

- Citokemijske mrlje koje koriste supstrate da bi pokazale prisutnost enzima

Te se mrlje temelje na inkubaciji biološkog uzorka s određenom supstratom, a reakcijski produkt zatim reagira s diazo solima kako bi tvorio obojeni kompleks.

esteraze

Ti su enzimi prisutni u lizosomima nekih krvnih stanica i sposobni su hidrolizirati organske estere koji oslobađaju naftil. Potonji tvori netopljivu azo boju kad se veže na diazovu sol, obojeći mjesto na kojem se odvija reakcija.

Postoji nekoliko supstrata i ovisno o tome koja se upotrebljava mogu se identificirati specifične esteraze i nespecifične esteraze. Prve su prisutne u nezrelim stanicama mijeloidne serije, a druge u stanicama monocitnog porijekla.

Supstrat koji se koristi za određivanje specifičnih esteraza je: naftol-AS-D kloroacetat. Iako se za određivanje nespecifičnih esteraza može upotrijebiti nekoliko supstrata, poput naftola AS-D acetata, alfa naftil acetata i alfa naftil butirata.

U oba slučaja stanice će postati tamno crvene kad je reakcija pozitivna.

mijclopcroksidazc

Ovaj enzim nalazi se u azurofilnim granulama granulocitnih ćelija i monocita.

Njegovo otkrivanje koristi se za razlikovanje leukemija mijeloidnog porijekla od limfoidnih. Stanice koje sadrže mijeloperoksidaze postaju oker žute.

fosfataza

Ti enzimi oslobađaju fosforne kiseline iz različitih supstrata. Oni se međusobno razlikuju prema specifičnosti supstrata, pH i djelovanju inhibitora i inaktivatora.

Među najpoznatijima su fosfomonoesteraze koje hidroliziraju jednostavne estere (PO). Primjer: alkalna fosfataza i kisela fosfataza, kao i fosfamidaze koje hidroliziraju veze (PN). Oni se koriste za razlikovanje limfoproliferativnih sindroma i za dijagnozu dlakave stanične leukemije.

- Trihromne boje

Mallary-Azan trihrom

Korisni su za razlikovanje citoplazme stanica od vlakana vezivnog tkiva. Stanice oboje crveno, a vlakna kolagena plavo.

Masson-ov trihrom

Ovo ima istu korisnost kao i prethodna, ali u ovom slučaju stanice se obojavaju crveno, a kolagena vlakna zeleno.

- Boje koje oboje specifične organele

Janus Green

Selektivno mrlja mitohondrije.

Srebrne soli i osmična kiselina

Mrlje Golgijev aparat.

Toluidin plava

Mrlje Nissijeva tijela

Srebrne soli i PAS

Boje retikularna vlakna i bazalnu laminu.

Orcein i fuksinski resorcin

Boje elastična vlakna. S prvom su obojeni smeđom, a s drugom duboko plavom ili ljubičastom.

- Ostale tehnike koje se koriste u citokemiji

Upotreba fluorescentnih tvari ili fluorokroma

Postoje tehnike koje koriste fluorescentne tvari za proučavanje položaja strukture u stanici. Te se reakcije vizualiziraju posebnim mikroskopom koji se zove fluorescencija. Primjer: IFI tehnika (indirektna imunofluorescencija).

Detekcija staničnih sastojaka imunocitohemijom

Ove su tehnike vrlo korisne u medicini jer pomažu u otkrivanju određene stanične strukture i ujedno je kvantificiraju. Ta se reakcija temelji na reakciji antigen-antitijelo. Na primjer: ELISA tehnike (Enzim imunološki test).

preporuke

- Za ocjenu dobre izvedbe boja potrebno je koristiti kontrolne mrlje.

- Za podvrgavanje citokemijskog bojenja potrebno je koristiti svježe mrlje. Ako nije moguće, treba ih čuvati zaštićene od svjetlosti i čuvati na 4 ° C.

- Pažljivo je da upotrijebljeni fiksativ ne utječe negativno na tvari koje se istražuju. Drugim riječima, treba ga spriječiti u mogućnosti da ga ekstrahira ili inhibira.

- Morate poštivati ​​vrijeme upotrebe fiksativa, jer općenito treba trajati samo nekoliko sekundi, jer duže izlaganje fiksativa može oštetiti neke enzime.

Reference

1. „Citokemija”. Wikipedia, Slobodna enciklopedija. 30 lipnja 2018, 17:34 UTC. 9. srpnja 2019., 02:53 Dostupno na: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Metode metalne impregnacije za ispitivanje retikularnih vlakana miokarda: komparativna studija. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Dostupno na: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Citohemija kisele fosfataze: metodološka razmatranja. Rev Diagn Biol. 200; 50 (2): 89-92. Dostupno na: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Stanična i molekularna biologija. 11. izdanje Uredništvo Ateneo. Buenos Aires, Argentina.
5. Klasični alati za proučavanje stanične biologije. TP 1 (dodatni materijal) - Stanična biologija. Dostupno na: dbbe.fcen.uba.ar