TCBS agar je sredstvo za visoko selektivni i diferencijalna kulturom, koji se koriste za izolaciju i uzgoj bakterije roda Vibrio cholerae, posebno, V. Vibrio parahaemolyticus i V. vulnificus kao glavnih uzročnika ove vrste.
Akronim TCBS kratica je Thiosulfate Citrate Bile Sucrose. Ovaj agar je također poznat kao selektivni medij za Vibrios. Izvornu formulu stvorio je Nakanishi, a kasnije modificirao Kobayashi.
Komercijalna ploča TCBS medija i TCBS agar zasađena je Vibrio kolerama. Izvor: fotografija 1: snimio autor MSc. Marielsa Gil / Fotografija 2: Microrao, JJMMC, Davangere, Karnataka, Indija
Sastoji se od ekstrakta kvasca, mesnog peptona, tripteina, natrijevog citrata, natrijevog tiosulfata, oks žuči, saharoze, natrijevog klorida, feritnog citrata, bromothimola plavog, timol plavog i agara.
Ovaj sastav omogućava adekvatan razvoj vrsta Vibrio iz uzoraka vode, hrane i izmeta; s izuzetkom Vibrio hollisae, koji ne raste na ovom mediju. Nadalje, TCBS medij je sposoban inhibirati rast ostalih pratećih bakterija, posebno koliforma.
Zbog ozbiljnih gastrointestinalnih i izvan-crijevnih problema koje proizvode neke vrste roda Vibrio, njegova dijagnoza je vrlo važna. Ljudi se zaraze uglavnom konzumiranjem sirove ili podrijetne hrane iz mora ili zagađenih voda, ali i infekcijom rana.
Zbog toga klinički laboratoriji moraju uključiti TCBS agar u studiju kulture stolice uzoraka tekućih stolica, posebno s pojavom rižine vode. Pogotovo ako pacijent izvijesti da je bio u kontaktu s morskom vodom ili da je konzumirao školjke ili ribu.
osnova
Ekstrakt kvasca, mesni peptoni i triptein hranjivi su izvor ovog medija. Međutim, TCBS agar je neugodan medij za većinu bakterija.
Njegova visoka selektivnost se daje dodatkom natrijevog citrata i vola žuči; oba su inhibicijska sredstva koja također pružaju alkalni pH mediju, ograničavajući rast prateće flore i pogodujući rastu V. kolere, među ostalim vrstama. Treba napomenuti da je Vibrio kolera vrlo osjetljiva na kiselost.
Natrijev klorid sa svoje strane osmotski uravnotežuje medij. Nadalje, pošto je njegova koncentracija velika, djeluje i kao inhibitorno sredstvo, pogodujući rastu halofilnih bakterija.
Suharoza je fermentirajući šećer koji, zajedno s bromothymol plavim i timol plavim pH pokazateljima, daju mediju svoj različit karakter. Iz tog razloga, pomoću ovog medija moguće je razlikovati fermentirajuće sojeve saharoze od onih koji ne fermentiraju.
Kolonije sojeva fermentacije saharoze razvijaju žutu boju i pretvarat će medij iz zelene u žutu zbog stvaranja kiseline. Ne-fermentori postaju prozirni, a medij ostaje izvorne boje (zelena).
Isto tako, ovaj medij sadrži natrijev tiosulfat kao izvor sumpora i feritni citrat kao sredstvo za razvijanje. Obje pokazuju bakterije koje su sposobne stvarati sumporovodik (bezbojni plin). H 2 S načinjen od tiosulfata i potom reakcijom s na feri citrat vidljivom crni talog.
Konačno, agar je ono što daje čvrstu konzistenciju mediju.
priprema
Odvažite 89 g dehidriranog medija i otopite u jednoj litri destilirane vode. Pomoći otapanju zagrijavanjem i čestim miješanjem. Smjesa se može kuhati do 2 minute.
Ovaj medij nije autoklavljen. Nakon otapanja servira se izravno na sterilnim tanjurima. Kad se stvrdnu, raspoređeni su na obrnuti način na trombocitima i čuvaju u hladnjaku (2-8 ° C) do upotrebe.
Medij nakon pripreme mora ostati na pH 8,6 ± 0,2.
Boja dehidriranog medija je svijetlo bež ili zelenkasto-bež, a boja medija je šumsko zelena ili plavkasto zelena.
Važno je da se ploče zagriju prije setve uzoraka.
Koristiti
Najčešći uzorak za izolaciju Vibriosa je stolica protiv proljeva.
Ako se uzorci stolice ne mogu odmah saditi na selektivni medij, treba ih transportirati na medij Cary Blair.
Da bi se povećala osjetljivost kulture, fekalije se mogu proći kroz peptonsku vodu pri pH 8,4 kao sredstvo za obogaćivanje najviše 8 sati, odakle se subkultivira u medij TCBS.
Također treba uzeti u obzir da neki sojevi virusa mogu izazvati septikemiju u bolesnika sa imunosupresijom, pa se mogu izolirati iz krvnih kultura. Isto tako, uzorci vode i hrane iz mora mogu se analizirati kada postoje epidemije epidemije kolere.
sije
Inokulum uzorka mora biti istaknut, sjetva se vrši metodom uklanjanja iscrpljenjem. Ploče se inkubiraju 24 sata pri 37 ° C u aerobiozi.
Pretpostavljene kolonije vibrio kolere srednje su veličine, glatke, neprozirne, tankih obruba i žute boje zbog fermentacije saharoze.
Na sličan način rastu vrste V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii i neki V. vulnificus. Ostale klinički važne vrste vibriosa, poput V. parahaemolyticus, ne fermentiraju saharozu, razvijajući se kao maslinasto zelene kolonije.
Ploča TCAR agar je zasijana Vibrio parahaemolyticus. Izvor: isis325 Flickr
S druge strane, mora se imati na umu da neki sojevi Aeromonas i Plesiomonas koji su oksidaza (+) mogu rasti u ovom mediju, razvijajući žute kolonije koje mogu zbuniti kliničara. Dok neki sojevi Pseudomonas također oksidaze (+) rastu kao zelene kolonije poput V. parahaemolyticus.
Ograničenje
Test oksidaze koji je pozitivan za rod Vibrio nikada se ne smije izvoditi iz kolonija dobivenih TCBS agarima, jer će dobiveni rezultat biti lažno negativan. Spojevi u sredini snažno ometaju ovaj test. Stoga se mora načiniti od subkultura na krvnom agaru.
QA
Da bi se dokazalo da je medij u dobrom stanju, preporučljivo je sijati poznate ili certificirane kontrolne sojeve i promatrati da li rast zadovoljava očekivane karakteristike.
Za to možete koristiti sojeve:
-Vibrio kolere - zadovoljavajući rast (žute kolonije, prozirna granica).
-Vibrio parahaemolyticus - zadovoljavajući rast (kolonija sa zelenim središtem i prozirnom granicom).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - zadovoljavajućeg rasta (žute kolonije sa halosima iste boje oko kolonije).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - potpuna ili djelomična inhibicija (male žute ili prozirne kolonije).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853- - djelomična ili potpuna inhibicija (plave kolonije).
-Escherichia coli ATCC 25922 - Potpuno inhibira.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 -– potpuna ili djelomična inhibicija. (Male kolonije prozirne granice zelenog središta).
Inkubacija neinokuliranog medija treba biti nepromijenjena.
Reference
- Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories. TCBS agar. 2009. Dostupno na: f-soria.es
- BD Laboratorij. BD. TCBS Agar 2003. Dostupno na: bd.com
- Britannia Laboratories. TCBS medij. 2015. Dostupno na: britanialab.com
- Acumedia Laboratories. TCBS Agar. 2016. Dostupno na: foodsafety.neogen.com
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiološka dijagnoza. 12 ed. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.