AGAR MRS: TEMELJ, PRIPREMA I UPOTREBA - BIOLOGIJA - 2026

Agar MRS selektivni krutina medij kulture se koristi za izolaciju i brojenje bakterija mliječne kiseline, posebice roda Lactobacillus. Ovaj agar su 1960. godine stvorili Man, Rogosa i Sharpe, a nosili su isti naziv, ali zbog njegove složenosti često se koristi kratica MRS.

Sastoji se od proteoznog peptona, ekstrakta mesa, ekstrakta kvasca, glukoze, sorbitan monoleata, dikalijevog fosfata, natrijevog acetata, amonijevog citrata, magnezijevog sulfata, manganovog sulfata i agara.

Sjeme man Rogosa i Sharpe Agar (MRS) s Lactobacillus sp. Izvor: Fotografiju koju su za ovaj članak donirali autori: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Fotografija snimljena tijekom istrage pod nazivom: Procjena bakterija mliječne kiseline i bifidobakterija s probiotskim potencijalom u majčinom mlijeku i dojenčadi stolice, Ovaj sastav omogućuje pravilan razvoj bakterija mliječne kiseline iz kliničkih uzoraka, kao što su izmet, vaginalni iscjedak, oralni uzorci i majčino mlijeko, kao i mliječna i mesna hrana.

Ne koristi se rutinski u kliničkim laboratorijima, jer su bakterijske mliječne kiseline rijetko uključene u procese bolesti. Međutim, na području mikrobiologije hrane, uporaba MRS-agara je češća.

S druge strane, ovaj medij koriste neki istraživački centri čiji je cilj ispitivanje bakterija mliječne kiseline.

osnova

Man, Rogosa i Sharpe agar ima prilično složen sastav. Razbijanjem funkcije svake njegove komponente može se objasniti njezin temelj.

Proteinski pepton, ekstrakt mesa, ekstrakt kvasca i glukoza hranjive su tvari koje pružaju izvor ugljika, dušika, vitamina i minerala potrebnih za rast bakterija. Nadalje, glukoza je univerzalni izvor energije koji se koristi u većini kultura.

S druge strane, da bi se favorizirao rast bakterija mliječne kiseline potrebno je prisustvo kofaktora (kationa) neophodnih u metabolizmu laktobacila i povezanih bakterija; Ti spojevi su soli natrija, magnezija i mangana.

Isto tako, sorbitan monoleat ili polisorbat 80 važan su izvor masnih kiselina jer se apsorbiraju kao hranjive tvari.

Nadalje, sorbitan monoleat i amonijev citrat djeluju inhibirajući razvoj prateće flore, posebno Gram negativnih bakterija, pružajući selektivni karakter ovog agara.

Konačno, agar-agar je onaj koji daje čvrstu konzistenciju mediju.

Postoje i druge inačice agara Man Rogosa Sharpe; jedan od njih je dopunjen cisteinom (MRSc), vrlo korisnim za izolaciju bifidobakterija, između ostalih mikroorganizama. S druge strane, postoji MRS medij nadopunjen neomicinom, paromomicinom, nalidiksičnom kiselinom i litijevim kloridom, poseban za selektivno brojanje bifidobakterija u mliječnim proizvodima.

priprema

Odvažite 68,25 grama dehidriranog medija i otopite u jednoj litri destilirane vode. Ostavite da stoji 5 minuta. Da se potpuno otopi, okrenite se izvoru topline, često miješajući i kuhajte 1 do 2 minute. Sterilizirajte u autoklavu na 121 ° C 15 minuta.

Kada napuštate autoklav, ostavite da odstoji nekoliko minuta i raspodijelite dok je još vruće u sterilnim Petrijevim posudama.

Ostavite da se stvrdne i okrene ploče, naručite u pločama i stavite u hladnjak do upotrebe. Ostavite ploče da se zagrije na sobnu temperaturu prije upotrebe.

PH sredstva treba biti 6,4 ± 0,2. Neke komercijalne kuće preporučuju pH između 5,5 do 5,9.

Dehidrirani medij je bež boje, a pripremljen je tamno jantarne boje.

I dehidrirani medij i pripremljene ploče treba čuvati na 2-8 ° C.

Prijave

Pločice s MRS agarima mogu se sijati površinski (iscrpljenost ili Drigalski lopatica). Može se sijati i po dubini. Ploče treba inkubira na 37 ° C u 4% microaerophilicity (O ₂ i 5-10% CO ₂) od 24 do 72 sata.

Način sjetve bira se prema željenoj svrsi (izolaciji ili prebrojavanju).

Karakteristike kolonija

Pretpostavljene kolonije Lactobacillusa postaju bjelkaste boje i na ovom agaru imaju mukoidni ili kremasti izgled. One se nakon toga moraju identificirati.

Izolacija bakterija mliječne kiseline

Za to se koristi površinska sjetva. Uzorci za sijanje zahtijevaju prethodni postupak.

U slučaju uzoraka majčinog mlijeka preporučuje se centrifugiranje 1 ml uzorka pri 14 000 okr / min tijekom 10 minuta, kako bi se uklonio masni sloj. 900 µl se odbaci, a u preostalih 100 µl talog se suspendira i izlije na površinu agara MRS, koji bi se zatim ravnomjerno rasporedio Drigalski lopaticom.

U slučaju uzoraka stolice, jedan (1) gram stolice izvaže se i homogenizira u 9 ml 0,1% sterilne peptonske vode, što odgovara razrjeđivanju 1/10. Potom se rade serijska razrjeđenja, dok se ne dobije konačno razrjeđenje od 10 ^-4.

Konačno, uzima se 100 ul od 10 ^-2, 10 ^-3 i 10 ^-4 razrjeđenja i svako razrjeđivanje sije se na MRS agar, ravnomjerno raspoređujući Drigalski lopaticom.

Broj bakterija mliječne kiseline

U ovom se slučaju sjetva vrši po dubini.

Za uzorke majčinog mlijeka uzima se 1 ml i stavi se u sterilnu konusnu plastičnu epruvetu. MRS agar se dodaje pri približnoj temperaturi od 40 ° C do konačnog volumena od 25 ml, čime se dobiva homogena smjesa. Nakon toga izlijeva se u sterilnu Petrijevu posudu na jednoličan način i ostavi da stoji do polimerizacije.

Za uzorke stolice izrađuju se razrjeđenja, kao što je prethodno opisano. Uzmite 1 ml svakog razrjeđenja i stavite ga u sterilne konusne plastične epruvete. Rastaljeni MRS agar dodan je u volumen od 25 ml.

Smjesa svakog razrjeđenja ravnomjerno se izlije u sterilne Petrijeve posude. Na kraju se ostavlja da se odmori do polimerizacije.

Kolonije računaju na agar Man Rogosa i Sharpe (MRS). Izvor: Fotografija je donirana za ovaj članak. Autori: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Fotografija snimljena tijekom istraživanja pod naslovom: Procjena bakterija mliječne kiseline i bifidobakterija s probiotičkim potencijalom u majčinom mlijeku i izmetu dojenčadi.

Razina istraživanja

Svakog dana proučavanje bakterija mliječne kiseline dobiva sve veći interes; Istraživači posebno traže da nauče o novim sojevima i njihovom potencijalu kao početni fermenti za standardizaciju u proizvodnji mliječnih proizvoda, između ostalih namjena.

U tom smislu, Alvarado i sur. (2007) koristili su MRS agar za provođenje studije u kojoj su izolirali, identificirali i okarakterizirali bakterije mliječne kiseline prisutne u zanatskom andskom dimljenom venecuelanskom siru.

U siru su otkrili prisutnost bakterija roda Lactococcus i Lactobacillus i zaključili da su mješavine izoliranih sojeva prikladne kao početni sojevi u proizvodnji sireva od pasteriziranog mlijeka.

S druge strane, Sánchez i sur. (2017) koristi MRS agar za ispitivanje prisutnosti bakterija mliječne kiseline u probavnom traktu prasića, kako bi ih se koristilo kao izvorne probiotike koji povećavaju produktivnost zdravih prasadi.

Pomoću ovog medija uspjeli su izdvojiti četiri vrste: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae i Pediococcus pentosaceus.

Isto tako, Báez i sur. (2019.) koristili su MRS agar za procjenu bakterija mliječne kiseline (LAB) i bifidobakterija s probiotičkim potencijalom u majčinom mlijeku i izmetu dojenčadi.

Uspjeli su izdvojiti 11 BAL i 3 Bifidobacteria sp u majčinom mlijeku i 8 BAL i 2 Bifidobacteria sp. u izmetu. Svi su zadovoljili određene parametre koji ih dokazuju kao bakterije s probiotičkim djelovanjem.

Autori su zaključili da i majčino mlijeko i izmet isključivo dojene djece služe kao prirodni izvori probiotičkih bakterija.

QA

Da biste procijenili kvalitetu MRS agara, kontrolirajte sojeve poput:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli i Bacillus cerei.

Očekivani rezultati su zadovoljavajući rast prvih 6 bakterija, dok se E. coli i Bacillus cereus moraju u potpunosti inhibirati.

Reference

1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Izolacija, identifikacija i karakterizacija bakterija mliječne kiseline iz venecuelanskog dimljenog andskog umjetnog sira. Njegova upotreba kao početna kultura. Dovoljni. (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301-308. Dostupno na: scielo.org.
2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro Izolacija bakterija mliječne kiseline iz probavnog trakta prasadi. Vlč. Istraga. veterinar. Peru 2017; 28 (3): 730-736. Dostupno na: scielo.org.
3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Procjena bakterija mliječne kiseline i bifidobakterija s probiotskim potencijalom u majčinom mlijeku i izmetu dojenčadi u općini Acevedo, Miranda 2017. Preddiplomski rad za stjecanje stupnja prvostupnika u bioanalizi. Sveučilište Carabobo, Venezuela.
4. Britannia Laboratory. MRS agar. 2015. Dostupno na: britanialab.com
5. Suradnici na Wikipediji. MRS agar. Wikipedia, Slobodna enciklopedija. 10. siječnja 2018., 19.44 UTC. Dostupno na: wikipedia.org Pristupljeno 17. veljače 2019. godine.
6. Roy D. Mediji za izolaciju i nabrajanje bifidobakterija u mliječnim proizvodima. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167-82.