MÜELLER HINTON AGAR: OSNOVA, PRIPREMA I UPOTREBE - BIOLOGIJA - 2026

Mueller Hinton agar nije selektivan, krutina hranjivi medij se sastoji od mesa, pepton infuzije kiseline kazein, škrob, agar i destilirane vode. Ovaj medij omogućava izvrstan rast mikroba za većinu brzo rastućih bakterija.

Izvorno su je stvorili John Howard Müeller i Jane Hinton kako bi izolirali zahtjevne bakterije poput Neisseria gonorrhoeae i Neisseria meningitidis. Međutim, zbog svojih karakteristika, pokazalo se da je idealno za ispitivanje osjetljivosti na antibiotike, što daje pouzdane i ponovljive rezultate.

Antibiogrami (Müeller Hinton agar). Izvor: Dr Graham Beards iz en.wikipedia

Stoga je Müeller Hinton agar medij kulture prihvaćen od strane Instituta za kliničke i laboratorijske standarde (CLSI) i Europskog odbora za ispitivanje osjetljivosti na antimikrobne pripravke za provođenje testa osjetljivosti na antimikrobne tvari diskusijskom metodom Kirby diska i Bauer.

osnova

Budući da je neselektivni hranjivi medij, izvrstan je za rast većine patogenih bakterija.

S druge strane, njegov jednostavni sastav čini tvari lako difuznim na njemu, što je ključna karakteristika za test osjetljivosti metodom disk difuzije.

Još jedna njegova karakteristika je da sadrži malu količinu inhibitora, što omogućava učinkovito ocjenjivanje sulfonamida, trimetoprima i tetraciklina.

Međutim, treba imati na umu da medij mora ispunjavati određene uvjete kako bi osigurao pravilno funkcioniranje, uključujući:

Prilagodba pH, dubine agara i odgovarajuće koncentracije timina, timidina, Ca ⁺⁺, Mg ⁺⁺ i Zn ⁺⁺.

Također morate znati da je metodologija standardizirana i stoga moraju biti ispunjeni svi parametri, kao što su:

Koncentracija inokuuluma, koncentracija i očuvanje diskova s ​​antibioticima, postavljanje odgovarajućeg broja diskova na agar, udaljenost između jednog i drugog diska, strateški plasman određenih antibiotika, atmosfera, temperatura i vrijeme inkubacije.

priprema

Odmjeriti 37 g dehidriranog Müeller Hinton medija i otopiti u 1 litri destilirane vode. Zagrijavajte medij uz miješanje da bi se postiglo otapanje. Prokuhajte 1 minutu.

Autoklav se sterilizira na 121 ° C 15 minuta. Kad se izvadi iz autoklava, tikvicu treba staviti u vodenu kupelj na 50 ° C da se ohladi. Ulijte 25 do 30 ml u sterilnu Petrijevu posudu promjera 10 cm.

Ploče trebaju biti prosječne debljine 4 mm (idealno), dopušteno je područje od 3-5 mm.

Ako želite pripremiti agar krvi koristeći Müeller Hinton agar kao bazu, sipajte 5% sterilnu i defibriniranu janjeću krv prije posluživanja na tanjure.

Konačni pH medija trebao bi biti između 7,2 i 7,4.

Uložite i čuvajte u hladnjaku, do upotrebe. Prije upotrebe pustite da tanjur dođe na sobnu temperaturu.

Boja pripremljenog medija je svijetlo bež.

Prijave

Koristi se za provođenje testa na antibiogram ili osjetljivost na antibiotike za najbrže rastuće ne zahtjevne patogene.

Ako se agar nadopunjuje krvlju, koristi se za provođenje antibiograma zahtjevnih mikroorganizama poput: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, između ostalih. Također se koristi za izoliranje Legionella pneumophila.

Antibiogramska tehnika

Prije provođenja antibiograma mora se pripremiti bakterijska otopina jednaka 1,5 x ¹⁰⁸ stanica.

Zbog toga se uzmu 3 do 4 kolonije čiste kulture i suspendiraju u soju tripticase u soji ili u Müeller Hinton bujonu, inkubiraju 2 do 6 sati, a koncentracija se podešava sterilnom fiziološkom otopinom, uspoređujući sa standardom Mac Farlanda od 0,5%.

Ako su zahtjevni mikroorganizmi, kolonije se mogu suspendirati izravno do koncentracije od 0,5% Mac Farlanda. Nakon toga, Müeller Hinton ploča zasijava se brisom impregniranim pripremljenom bakterijskom otopinom.

Da biste to učinili, bris se uroni u otopinu, a zatim se višak tekućine uklanja pritiskom na zidove cijevi. Odmah nakon toga, bris se prostire po cijeloj površini, ne ostavljajući mjesta nedirnutim, zatim se ploča lagano zakreće i ponovo se sjeme. Operacija se ponavlja još 2 puta.

Ostavite stajati 10 minuta, a zatim umetnite diskove sa antibioticima sterilnim pincetama, ostavljajući razmak od 24 mm između njih. Nakon što svaki disk stavite na agar, svaki disk lagano pritisnite pincetama kako biste osigurali da se dobro prianjaju.

Kad je postupak gotov, ploča je invertirana i inkubirana na 35-37 ° C u aerobiozi 16 do 18 sati. Ako se radi o zahtjevnom mikroorganizmu, može zaslužiti mikroaerofiliju, a ako antibiogram sadrži diskove oksacilina, trebalo bi ih pročitati nakon 24 sata.

Ravnatelj se koristi za mjerenje promjera svake halo. Rezultati se bilježe u mm. Potom se dobivene vrijednosti povezuju s tablicama graničnih točaka objavljenih u trenutnom CLSI-ovom priručniku.

Mjerenje halo inhibicije. Izvor: USCDCP, Pixnio.com

Izvijestite o osjetljivoj (S), srednjoj (I) ili otpornoj (R), ovisno o slučaju.

Antibiotici se odabiru prema izoliranom mikroorganizmu i vrsti infekcije koju proizvode.

Ponekad se mora imati na umu strateški plasman antibiotika koji otkriva fenotipske obrasce rezistencije.

Strateško postavljanje diska na Müeller Hinton agar

Za enterobakterije, disk s klavulanskom kiselinom treba postaviti protiv cefalosporina 3. i 4. generacije. Proširenje u obliku jajeta ukazuje da je soj beta-laktamaza proširenog spektra (ESBL). To znači da pacijenta ne treba liječiti nikakvim cefalosporinima.

Fenotipska ekspresija produkcije beta-laktamaze proširenog spektra (ESBL) u soju Escherichia coli. Izvor: Fotografiju snimio autor MSc. Marielsa gil

Kod stafilokoka je važno postaviti disk eritromicina ili azitromicina ispred diska s klindamicinom (D-test).

Otporni halo u eritromicinu i spljoštenost halo klindamicina ukazuje da soj posjeduje otpornost na klindamicin (ICR). To znači da liječenje klindamicinom neće biti učinkovito.

Za traženje inducibilnih sojeva AMP C u Enterobacteriaceae i nekim ne-fermentirajućim Gram-negativnim šipkama, diskovi tazobaktan ceftazidime, cefoksitin ili piperacilin su okrenuti prema imipenem disku, na udaljenosti od 27 mm.

Isplovan halo u jednom od diskova okrenut imipenemu ukazuje na prisutnost inducibilnog AMP C.

Za potragu za konstitutivnim AMP C, 500 µg kloksacilin disk suočen je s ceftazidimom (30 µg) i cefotaksimom (30 µg), na udaljenosti od 25 mm. Prošireni halo u bilo kojem od cefalosporina ukazuje na pozitivnost.

Cloxacillin disk se također može zamijeniti 9 mm diskom filtera Whatman No. 6, impregniranim fenil bornom kiselinom (400 µg) s razmakom od 18 mm. Tumači se isto kao i prethodna.

Konačno, za ispitivanje proizvodnje metalobetalaktamaza, posebno kod Pseudomonas aeruginosa, koristi se disk impregniran s 10 ul etilendiaminetetraoctene kiseline (EDTA 750 µg) i tioglikolne kiseline (SMA 300 µg), koji je suočen s imipenemom i meropenemskim diskovima na udaljenosti od 15 mm.

Ispitivanje je pozitivno ako postoji širenje halo imipenema ili meropenema prema EDTA / SMA disku. Ovaj rezultat mora biti potvrđen modificiranim Hodge testom.

Ova metoda sastoji se od inokulacije soja Escherichia coli ATCC 25922 na pločicu Müeller Hinton. Disk imipenema se postavlja u sredinu ploče, a zatim se od diska do periferije postavlja trak sa sumnjom na soj P. aeruginosa. Na ploču se mogu ispitati najviše 4 soja.

Test će biti pozitivan ako postoji zona izobličenja imipenem halo oko strije.

Uzroci pogrešnih rezultata

- Loše sačuvani antibiotski diskovi mogu proizvesti lažnu otpornost. Na primjer, oksacilinski disk vrlo je osjetljiv na promjene temperature.

-PH pH medija ispod navedenog (kiselog) stvara manje haloge u aminoglikozidima i makrolidima (rizik od lažne rezistencije), a veće halogene u penicilinu, tetraciklini i novobiocinu (rizik od lažne osjetljivosti).

-Ako je pH iznad navedenog (alkalni) gore opisani efekti se poništavaju.

-Medija s visokim koncentracijama timina i timidina ima utjecaj, značajno smanjujući halogene inhibicije sulfonamida i trimetoprima.

-Visoke koncentracije kalcija i magnezija stvaraju lažnu otpornost aminoglikozida, polimiksina B i tetraciklina protiv sojeva Pseudomonas aeruginosa.

-Neke koncentracije kalcija i magnezija stvaraju lažnu osjetljivost aminoglikozida, polimiksina B i tetraciklina protiv sojeva Pseudomonas aeruginosa.

- Prisutnost cinka utječe na rezultate karbapenemskih diskova (imipenem, meropenem i ertapenem).

-Dostupnost medija ispod 3 mm stvorit će lažne rezultate osjetljivosti, dok debljina iznad 5 stvorit će lažni otpor.

-Mobilizacijom diskova u antibiogramu dat će se deformirani oreoli jer je pražnjenje antibiotika trenutno.

- Vrlo slabi inokuli utječu na rezultate, jer neće biti jednolikog ili spojenog rasta u agaru, što je nužan uvjet da se mogu mjeriti inhibicijski halosi, uz činjenicu da halosi mogu dati veće nego što je normalno.

-Nezauzeto inokula može stvoriti haloge manje nego što je to uobičajeno.

-Ne poštujući udaljenost između diskova, jedan halo se preklapa s drugim i ne može ih ispravno pročitati.

- Inkubacija s CO ₂ povećava veličinu haloa tetraciklinskih i meticilinskih diskova.

-Ikubira na temperaturama ispod 35 ° C stvara veće halogene.

-Dodatkom krvi smanjuje se količina halogenid sulfa.

Ograničenje

Osjetljivost antibiotika koja se pokazuje na antibiogramu protiv mikroorganizma (in vitro) nije jamstvo da će djelovati in vivo.

QA

Da biste znali sadrži li medij odgovarajuću količinu timina, mora se zasaditi soj Enterococcus faecalis ATCC 29212, a osjetljivost na trimetoprim sulfametoksazol (SXT) mora dati halo jednak ili> 20 mm da bi bio zadovoljavajući.

Reference

1. "Müller-Hinton agar." Wikipedia, Slobodna enciklopedija. 16. studenog 2018., 12.23 UTC. 27 sij 2019., 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiološka dijagnoza. 12 ed. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
3. Cona E. Uvjeti za dobru studiju osjetljivosti agar difuzijskim testom. Rev Chil Infect, 2002.; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratorij. Müeller Hinton agar s 5% ovčje krvi. 2009. Dostupno na:
5. BD Müeller Hinton II Agar Laboratory. 2017. Dostupno na:.bd.com
6. Britannia Laboratories. Müeller Hinton agar. 2015. Dostupno na: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
8. Martínez-Rojas D. betalaktamaze tipa AmpC: Općenitosti i metode za fenotipsku detekciju. Vlč. Microhiol. 2009; 29 (2): 78-83. Dostupno na: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotipska detekcija metalobetalaktamaza u kliničkim izolatima Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Dostupno na: scielo.org.