EMB agar je selektivni i diferencijal medij korišten za izolaciju krutina kulture Gram negativnih bacila, posebno Enterobacteriaceae i drugi Gram negativnih bakterija nezahtjevna. Poznat je i po akronimu EAM, koji označava eozin-metilensko plavu boju.
Ovaj medij stvorili su Holt-Harris i Teague 1916. Sadrži pepton, laktozu, saharozu, kalijev fosfat, agar, eozin, metilen plavu i vodu. Vrlo je sličan MacConkey Agar-u, posebno kada se koristi Levineov Modificirani EMB Agar koji ne sadrži saharozu.
Metalni sjaj Escherichia coli na EMB agaru Izvor: Carmen Moreno González, iz Wikimedia Commons
Zapravo, svaki laboratorij odlučuje hoće li raditi s jednim ili drugim, budući da oni obavljaju istu funkciju, iako su biokemijski različite.
Ima čak i isti nedostatak kao i klasični MacConkey agar što se tiče brze proizvodnje roda Proteus. Stoga, da bi se izbjegao ovaj fenomen, koncentracija agara može se povećati do 5%.
osnova
selektivan
EMB agar suptilno je selektivan jer sadrži anilinske boje (eozin i metilen plavu), koje djeluju kao inhibitori, sprječavajući rast većine Gram pozitivnih bakterija i nekih brzih Gram negativnih šipki.
Međutim, ovaj agar ima nedostatak što neke Gram pozitivne bakterije mogu odoljeti prisutnosti inhibicijskih tvari i rasti kao male bezbojne punktatne kolonije, kao što su Enterococcus faecalis i neki stafilokok.
Također mogu narasti i određeni kvasci, poput kompleksa Candida albicans, koji će dati vrlo male ružičaste kolonije. Klamidospore se mogu razviti čak i iz ovog kvasca ako je uzorak duboko zasijan.
Diferencijal
S druge strane, EMB agar je također diferencijalni medij, budući da ta obojena bojila (eozin i metilen plavi) imaju svojstvo stvaranja taloga pri kiselom pH, pa služe kao pokazatelji njegove proizvodnje.
Dakle, slabo fermentirajuće bakterije laktoze ili saharoze stvaraju ljubičaste kolonije u roku od 24 do 48 sati. Na primjer, rodovi Klebsiella, Enterobacter i Serratia.
One bakterije koje snažno fermentiraju laktozu, poput Escherichia coli ili saharoze, poput Yersinia enterocolitica ili Proteus penneri, tvore zelenkasto-crni talog, koji daje karakterističan metalni sjaj kod ovih vrsta.
Treba napomenuti da će se, ako se koristi levinski medij EMB (bez saharoze), Yersinia enterocolitica i Proteus penneri stvoriti bistre kolonije.
Bakterije koje ne fermentiraju laktozu ili saharozu neguju se prisutnošću peptona koji osiguravaju aminokiseline i dušik potreban za rast bakterija i stvaraju bistre kolonije. Na primjer, rodovi Salmonella i Shigella, između ostalih.
Isto tako, važno je napomenuti da rod Acinetobacter može predstavljati kolonije plave boje lavande, iako nije ferment laktoze ili saharoze, ali ima svojstvo fiksiranja metilen plave boje u staničnoj stijenci. To se može dogoditi i s drugim oksidativnim bakterijama.
priprema
Izvorni dehidrirani medij je svijetlo bež boje.
Za pripremu ovog kultivacijskog medija, 36 grama dehidriranog medija mora se izvagati i suspendirati u tikvici koja sadrži jednu litru destilirane vode.
Nakon što ostavite smjesu da odstoji 5 minuta, stavite tikvicu na izvor topline, energično miješajući i neprestano dok se ne zagrije i ne otopi u potpunosti.
Nakon toga, već otopljeni medij za kulturu mora se sterilizirati autoklavom na 121 ° C 15 minuta.
Na kraju vremena uklanja se iz autoklava i ostavlja kratko da odstoji. Zatim se, još toplo (45-50 ° C), u svaku sterilnu Petrijevu posudu posluži 15-20 ml agarja. Medij treba biti lakmusno plav.
Nakon posluživanja tanjiri se ostave malo otkriti dok se agar malo ne ohladi. Potom se prekriju i ostave da se potpuno očvrsnu. Nakon toga smještaju se u obrnuti držač za tanjure i čuvaju u hladnjaku (8 ° C) do upotrebe.
Postupak se provodi u poklopcu za laminarni protok ili ispred Bunsenovog plamenika kako bi se izbjegla kontaminacija.
Važno je imati na umu da će svaka trgovačka kuća navesti količinu koja će se izvagati za pripremu medija za kulturu.
Konačni pH medija mora biti 7,2 ± 0,2
Prijave
Taj se medij koristi za sjetvu urina i fekalija ili bilo koje vrste kliničkog uzorka, posebno ako se sumnja na prisutnost nonšastnih Gram negativnih bacila, poput bacila koji pripadaju obitelji Enterobacteriaceae, koji na ovom mediju vrlo dobro rastu.
Enteropatogene bakterije roda Shigella i Salmonella razlikuju se po bezbojnim ili blago jantarnim kolonijama.
Između ostalog, rastu i druge ne-laktozne fermentirajuće bacile, poput Aeromonas, Pseudomonas, Acinetobacter.
Isto tako, ovaj je medij vrlo koristan u mikrobiološkoj analizi hrane i vode, jer je idealan za potpunu potvrdnu fazu određivanja koliformi, odnosno za potvrđivanje prisutnosti E. coli iz mutnih EC bujona iz od najvjerojatnije brojevne tehnike (MPN).
QA
Kako bi se provjerilo da svježe pripremljeni medij za kulturu djeluje dobro, kontrolni sojevi se mogu posaditi kako bi se promatrale karakteristike kolonija i provjerilo da li daju kako je i očekivano.
Za to se mogu koristiti sojevi ATCC ili dobro identificirani sojevi E. coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella sp, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa i neke Gram pozitivne bakterije, kao što je S. aureus.
Očekuje se da će E. coli stvoriti dobro razvijene plavo-crne kolonije sa zelenim metalnim sjajem. Dok bi Enterobacter aerogenes i Klebsiella sp trebali dati dobro razvijene plavkasto-crne sluznice.
S druge strane, Salmonella typhimurium i Shigella flexneri moraju razviti velike kolonije, bezbojne ili s blagom jantarnom bojom.
Konačno, rod Pseudomonas aeruginosa raste kao bezbojne kolonije nepravilne veličine, dok gram-pozitivne bakterije treba potpuno inhibirati ili rijetko rasti s vrlo malim kolonijama.
Završne misli
Ponekad sterilizacijom dolazi do smanjenja metilen plave boje, pokazuje srednju narančastu boju. Da bi metilen plava oksidirala i dobila ljubičastu boju, mora se lagano miješati dok se boja ne dobije.
Također, nakon sterilizacije, boja se može istaložiti, pa je dobro promiješajte prije posluživanja Petrijeve posude.
Reference
- Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B i Velázquez O. 2009. Tehnike mikrobiološke analize hrane. 2. izd. Kemijski fakultet, UNAM. Meksiko.
- Carranza C, León R, Falcón N, Neumann A, Kromm C. Karakterizacija i distribucija potencijalno patogenih sojeva Escherichia coli izoliranih od pilića-brojlera s peradarskih farmi u Peruu. Vlč. Istraga. veterinar. Peru 2012. 23 (2): 209-219. Dostupno na: scielo.org.
- Laboratorios Conda SA eozin i metilen plavi agar. 2010. Dostupno na: condalab.com
- Britannia Laboratories. Levine EMB (s eozinom i metilen plavim) 2011. Dostupno na: britanialab.com
- BD Laboratoriji. BD EMB agar (eozin metilen plavi agar), modificirano. 2013. Dostupno na: bd.com
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. (5. izd.). Argentina, uredništvo Panamericana SA
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiološka dijagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Uredništvo Panamericana SA