Agar Simmons citrat je krutina medij koristi kao biokemijskih identifikaciju test mikroorganizama, posebno gram - negativnih bacila. Izvorni medij stvorio je Koser 1923. godine.
Koserov citratni medij sastojao se od juhe koja sadrži natrijev fosfat, amonijev fosfat, monokalijev fosfat, magnezijev sulfat i natrijev citrat.
A. Dehidrirani Simmons citratni agar komercijalni medij B. Pripremljeni Simmons citratni agar. Izvor: A. Fotografiju snimio MSc. Marielsa Gil B. Roto2esdios, iz Wikimedia Commons
Kao što se može vidjeti, jedini izvor ugljika u mediju je citrat, a dušika je amonijev fosfat, izostavljajući bjelančevine i ugljikohidrate kao izvor tih elemenata, oni su obično prisutni u drugim medijima.
Stoga se bakterija inokulirana u ovom mediju može razmnožavati samo ako je sposobna preuzeti ugljik iz citrata. Test je bio pozitivan ako je postojala zamućenost u mediju, međutim imao je nedostatak što se može pojaviti nespecifična zamućenost.
Ovaj je problem riješio Simmons dodavanjem bromothymol plave boje i agar Koserovoj originalnoj formuli. Iako je načelo isto, tumači se različito.
osnova
Neke bakterije imaju sposobnost preživljavanja u nedostatku fermentacije ili proizvodnje mliječne kiseline, pri čemu moraju dobiti energiju pomoću drugih supstrata. U ovom testu jedini ponuđeni izvor ugljika je citrat.
Bakterije koje su sposobne preživjeti u tim uvjetima brzo metaboliziraju citrat, alternativno tradicionalnom putu, koristeći ciklus trikarboksilne kiseline ili ciklus fermentacije citrata.
Katabolizam citrata od strane bakterija uključuje enzimatski mehanizam bez intervencije koenzima A. Ovaj enzim poznat je po nazivu citricaza (citratna oksaloacetat-liza) ili citratna desmolaza. Za reakciju je potrebna prisutnost dvovalentnog kationa koji se u tom slučaju opskrbljuje magnezijem.
Reakcijom nastaju oksaloacetat i piruvat, koji potom stvaraju organske kiseline usred alkalnog pH nastalog korištenjem izvora dušika. Ove organske kiseline koriste se kao izvor ugljika koji stvara karbonate i bikarbonate, dodatno alkalizirajući okoliš.
Način sjetve
Simmons citratni medij treba lagano inokulirati u riblje meso pomoću ravne petlje ili igle i inkubirati 24 sata na 35-37 ° C. Nakon vremena, promatraju se rezultati.
Sjetva se vrši samo na površini agara. Ne probijajte.
Tumačenje
Ako medij ostane izvorne boje (zelena) i nema vidljivog rasta, test je negativan, ali ako medij postane plav, ukazuje na prisustvo alkalnih proizvoda, što se otkriva pH pokazateljem. U ovom slučaju test je pozitivan.
Citrat (+) i (-). Izvor: MSc Marielsa gil
To se događa jer ako bakterija koristi ugljik citrat, također je sposobna uzimati dušik amonijevog fosfata s kojim oslobađa amonijak, alkalizirajući medij.
S druge strane, ako se opazi rast bakterija u mediju, ali nema promjene boje, test se također mora smatrati pozitivnim, jer ako postoji rast, to znači da je bakterija mogla koristiti citrat kao izvor ugljika, iako trenutno nema promjene pH vrijednosti (ponekad može potrajati vrijeme).
Ako postoji dvojba u interpretaciji konačne boje, može se usporediti s ne inokuliranom cijevi od citrata.
priprema
Za jednu litru vode odmjeri se 24,2 g dehidriranog medija. Pomiješajte i ostavite da odstoji oko 5 minuta. Završite otapanje medija zagrijavanjem 1 ili dvije minute, često mućkajući.
Ulijte 4 ml u epruvete i autoklavite na 121 ° C 15 minuta. Kada napuštate autoklav, nagnite se uz pomoć oslonca na takav način da se agar očvrsne u obliku kljuna flaute s malim blokom ili dnom i više nagiba.
Konačni pH citratnog medija je 6,9 (zelena boja). Ovaj medij je vrlo osjetljiv na promjene u pH vrijednosti.
Pri pH 6 ili nižem, medij postaje žut. Ova boja se ne opaža na testu na bakterije.
A pri pH 7,6 ili više, medij postaje duboko prusko plav.
Koristiti
Simmons Citrate Agar koristi se za identifikaciju određenih mikroorganizama, posebno bacila koji pripadaju obitelji Enterobacteriaceae i drugih fermentacijskih bacila bez glukoze.
Izvor: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
Završne misli
Simmons citratni medij vrlo je osjetljiv test jer se mogu pogriješiti ako se naprave određene pogreške.
Treba obratiti pažnju na sljedeće:
inokuluma
Ne smije se napraviti jako gust ili opterećen bakterijski inokulum, jer može uzrokovati da se na mjestu sjetve razvije bakreno žuta boja, bez utjecaja na ostatak medija, ali može dovesti do vjerovanja da postoji rast. To ne znači pozitivnost testa.
Također, gusti inokulum može stvoriti lažno pozitivan rezultat, jer organski spojevi formirani unutar staničnih stijenki umirućih bakterija mogu otpustiti dovoljno ugljika i dušika da bi se pretvorio pH pokazatelj.
Stoga je idealno sijati s iglom umjesto ručke od platine kako se ne bi uzimao višak materijala.
sije
S druge strane, kada se baterija biokemijskih ispitivanja za identifikaciju dotičnog mikroorganizma sadi, važno je da se citratni test prvi inokulira, kako bi se izbjeglo prenošenje proteina ili ugljikohidrata iz drugog medija.
Pod ovom je okolnošću moguće dobiti lažno pozitivan učinak, jer će se bilo koja od ovih tvari koje unesemo greškom metabolizirati i uzrokovati promjenu pH vrijednosti.
Drugi način da se izbjegne prijenos tvari je izgaranje petlje i uzimanje novog inokuluma između jednog i drugog testa.
Također se mora paziti na dodir s kolonijom da bi se izvršio inokulum, jer treba izbjegavati povlačenje dijela agara iz kulture iz koje dolaze bakterije, zbog gore navedenog.
U tom smislu, Matsen, Sherris i Branson preporučuju razrjeđivanje inokuluma u fiziološkoj otopini prije inokulacije citratnim testom kako bi se izbjegao prijenos drugih izvora ugljika.
Intenzitet boje
Treba uzeti u obzir da se intenzitet boje proizveden kad je test pozitivan može varirati ovisno o komercijalnoj kući.
Osim toga, postoje mikroorganizmi koji testiraju pozitivnost u roku od 24 sata, ali postoje i drugi sojevi kojima je potrebno 48 sati ili više da bi se promijenila pH.
Reference
- Mac Faddin J. (2003). Biokemijski testovi za identifikaciju bakterija kliničkog značaja. 3. izd. Uredništvo Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiološka dijagnoza. 12 ed. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
- BD Laboratoriji. BBL Simmons Citrate Agar Slants. 2015. Dostupno na: bd.com
- Britannia Laboratories. Simmons Citrate Agar. 2015. Dostupno na: britanialab.com
- Valtek dijagnostičke laboratorije. Simmons Citrate Agar. 2016. Dostupno na: andinamedica.com.