REKOMBINANTNA DNA: TEHNIKA, PRIMJENE I OSNOVE - BIOLOGIJA - 2026

Rekombinantne DNA (rDNA ili rDNA) je umjetni nukleinska kiselina molekula stvorena u laboratoriju, integrirajući dvije zanimljive segmente organizacije. Poznat je i pod nazivom himerna DNA, zahvaljujući svom hibridnom svojstvu. Ova vrsta DNK se ne nalazi u prirodi.

Osnovna metodologija za njezino stvaranje uključuje: (a) odabir ciljane DNK i njegovo umetanje u drugi fragment DNA (općenito bakterijski plazmid); (b) uvođenje ovog plazmida u bakteriju, (c) selekciju bakterija pomoću antibiotika i konačno (d) ekspresiju gena.

Izvor: pixabay.com

Ova tehnika koristi skup enzima koji omogućuju kopiranje i lijepljenje određenih fragmenata DNA prema prosudbi istraživača.

Cilj rekombinantne tehnologije je u većini slučajeva ekspresija proteina (poznatog kao rekombinantni protein) koji želi molekularni biolog za buduća istraživanja ili stvaranje proteina komercijalne i terapijske vrijednosti - kao što je ljudski inzulin, na primjer.

Osnove tehnike rekombinantne DNA i njezina upotreba u genetskom inženjerstvu

Središnja dogma molekularne biologije

Sva organska bića koja poznajemo dijele nekoliko karakteristika. Jedna od njih je i priroda genetskog materijala i način stvaranja proteina - proces poznat kao središnja „dogma“ molekularne biologije.

S izuzetkom nekoliko virusa, svi organizmi pohranjuju genetske informacije u DNK (deoksiribonukleinska kiselina), prikupljena na vrlo kompaktan i organiziran način u jezgri stanice.

Radi ekspresije gena, molekula DNK prepisuje se u glasnik RNA, a potonja se prevodi na jezik aminokiselina, građevne bjelančevine proteina.

Što je rekombinantna DNA?

Između 1970-ih i 1980-ih, molekularni biolozi počeli su koristiti prednosti procesa koji se prirodno događaju unutar stanice i mogli su ih ekstrapolirati u laboratorij.

Na taj način, gen životinjskog podrijetla (na primjer, kralježnjak) može se ubaciti u segment DNA iz bakterije; ili se DNA bakterije može kombinirati s virusnom DNK. Prema tome, rekombinantnu DNK možemo definirati kao molekulu sastavljenu od DNK iz dva različita organizma.

Jednom kada je stvorena ova hibridna ili rekombinantna molekula, gen se zanima. Riječnim izrazom želimo se odnositi na proces prevođenja proteina.

Restriktivni enzimi i ligaze: ključ procesa

Otkrivanje restrikcijskih enzima bio je ključni element u razvoju rekombinantne DNA tehnologije.

To su proteinske molekule koje pokazuju sposobnost cijepanja DNA (nukleaze) u specifične sekvence, a služe kao "molekularne škare". Fragmenti koje stvaraju ti enzimi nazivaju se fragmenti restrikcije.

Spomenuti enzimi mogu proizvesti simetrične rezove u ciljnoj sekvenci (u oba lanca na istoj visini) ili asimetrične rezove. Ključni aspekt djelovanja restrikcijskih enzima jest da se nakon cijepanja lanaca dobije "labavi rub", komplementarni drugom rubu koji je istisnut istim enzimom.

Neki su primjeri ECOR 1 i Sma 1. Trenutno je poznato više od 200 vrsta restrikcijskih enzima.

Da bi bile korisne, škare moraju biti popraćene ljepilom. To djelovanje zaptivanja DNA (prethodno tretirane restrikcijskim enzimima) provode ligaze.

Tehnika: kako se DNK organizma umjetno mijenja u laboratoriju?

U nastavku ćemo opisati glavne korake koje zahtijeva rekombinantna DNA tehnologija. Sve to provode profesionalci u laboratoriju za molekularnu biologiju.

Što je "klon"?

Prije nego što nastavimo s eksperimentalnim protokolom, moramo napomenuti da se u molekularnoj biologiji i biotehnologiji široko koriste termini "klon" i glagol "klon". To bi moglo dovesti do zbrke.

U tom kontekstu ne mislimo na kloniranje čitavog organizma (kao na primjer u slučaju čuvene ovce Dolly), već na kloniranje komada DNK, koji može biti gen. Odnosno, stvaranje mnogih kopija - genetski identičnih - niza.

1. Izolacija i dobivanje DNA

Prvi korak je odlučiti koji redoslijed želite koristiti. To u potpunosti ovisi o istraživaču i ciljevima njegova rada. Tada se ova DNK mora izolirati i pročistiti. Metode i postupci za postizanje toga ovise o tijelu i tkivu.

Općenito, uzme se dio tkiva i podvrgne se tretiranju u puferu za lizu s proteinazom K (proteolitičkim enzimom), a zatim se ekstrahira DNK. Nakon toga, genetski materijal se dijeli na male fragmente.

2. Vektor kloniranja

Nakon pripremnih koraka, istraživač pokušava uvesti DNK segment od interesa u vektor kloniranja. Od sada ćemo ovaj segment DNK nazvati bijelim DNA.

plazmidi

Jedan od najčešće korištenih vektora u plazmidu bakterijskog porijekla. Plazmid je dvolančana, kružna molekula DNA koja se prirodno nalazi u bakterijama. Strani su bakterijski kromosom - to jest, ekstrahromosomni su i nalaze se prirodno u tim prokariotima.

Osnovni elementi vektora su: (a) izvor replikacije koji omogućava sintezu DNA; (b) sredstva za selekciju, koja omogućava identifikaciju organizama koji nose plazmid s ciljanom DNK, poput otpornosti na neki antibiotik; i (c) mjesto multikloniranja, gdje se nalaze sljedovi koje će prepoznati restrikcijski enzimi.

Prvi uspješni rekombinantni DNA u laboratoriju kloniran je u plazmid pSC101 iz bakterije E. coli. Sadrži mjesto restrikcije za restrikcijski enzim EcoRI i gen za rezistenciju na antibiotik, osim podrijetla replikacije.

Umetanje ciljne DNK u plazmid provodi se pomoću molekularnih alata restrikcijskih enzima i ligaza opisanih u prethodnom odjeljku.

Preostale vrste vektora

Osim plazmida, DNA se može umetnuti u druge vektore, kao što su lambda bakteriofaga, kozmidi, YAC-ovi (umjetni kromosomi kvasca), BAC-ovi (bakterijski umjetni kromosomi) i fagemidi.

3. Uvođenje rekombinantne DNA

Jednom kada se dobije rekombinantna molekula DNA (gen koji zanima u plazmidu ili drugom vektoru), ona se unosi u organizam domaćina ili domaćina, što može biti bakterija.

Za uvođenje stranih DNK u bakteriju koristi se tehnika koja se naziva transformacija bakterija, gdje se organizam podvrgava tretmanu dvovalentnim kationima koji ga čini osjetljivim na unos DNK.

Metodološki, ne možemo jamčiti da je 100% bakterija u našoj kulturi učinkovito preuzelo našu rekombinantnu molekulu DNK. Tu dolazi do izražaja dio plazmida koji sadrži otpornost na antibiotike.

Tako će bakterije koje su preuzele plazmid biti otporne na određeni antibiotik. Da biste ih odabrali, dovoljno će biti primijeniti navedeni antibiotik i odvesti preživjele.

4. "Žetva" proteina

Nakon odabira bakterija s našim rekombinantnim DNK, nastavljamo s korištenjem domaćeg enzimatskog mehanizma za generiranje proteinskog proizvoda koji nas zanima. Kako se bakterije razmnožavaju, plazmid se prenosi na njihovo potomstvo, tako da se ne gubi tijekom odjeljenja.

Ovaj postupak koristi bakterije kao svojevrsnu tvornicu proteina. Kasnije ćemo vidjeti da je to bio vrlo relevantan postupak u razvoju učinkovitih medicinskih tretmana.

Nakon što je kultura spremna i bakterije su proizvele velike količine proteina, stanica se lizira ili uništava. Postoji širok raspon biokemijskih tehnika koje omogućuju pročišćavanje proteina prema njihovim fizikalno-kemijskim karakteristikama.

U drugom eksperimentalnom kontekstu možda nas ne zanima stvaranje proteina, već smo zainteresirani za dobivanje DNA sekvence po sebi. Da je to slučaj, plazmid bi se koristio za stvaranje višestrukih kopija zanimljivog fragmenta kako bi se na njemu našlo dovoljno ciljne DNK za provođenje relevantnih eksperimenata.

Prijave

Rekombinantna DNK tehnologija otvorila je beskonačan broj mogućnosti u molekularnoj biologiji, biotehnologiji, medicini i drugim srodnim područjima. Njegove najistaknutije primjene su sljedeće.

Genetska analiza

Prva primjena izravno je povezana s laboratorijima za molekularnu biologiju. Rekombinantna DNK tehnologija omogućuje istraživačima da razumiju normalnu funkciju gena, a generirani proteini mogu se koristiti u daljnjem istraživanju.

Farmaceutska industrija

Proteini dobiveni primjenom postupka rekombinantne DNA imaju primjenu u medicini. Dva vrlo relevantna primjera na ovom polju su humani inzulin i hormon rasta, koji se primjenjuje na pacijentima kojima nedostaje ovog proteina.

Zahvaljujući rekombinantnoj DNK, ti se proteini mogu stvoriti bez potrebe da ih se izvadi iz drugog čovjeka, što predstavlja dodatne metodološke komplikacije i zdravstvene rizike. To je pomoglo poboljšati kvalitetu života za bezbroj pacijenata.

Reference

1. Baca, LEL, & Álvarez, CLC (2015). Biologija 2. Grupo uredništvo Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE i Hausman, RE (2000). Stanica: molekularni pristup (svezak 10). Washington, DC: ASM press.
3. Devlin, TM (2004). Biokemija: udžbenik s kliničkom primjenom. Preokrenuo sam se.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Uloga rekombinantne DNA tehnologije u poboljšanju života. Međunarodni časopis za genomiku, 2016., 2405954.
5. Mindán, FP, i Mindan, P. (1996). Patološka anatomija. Elsevier Španjolska.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Uvod u mikrobiologiju. Panamerican Medical Ed.
7. The MJ (1989). Ljudski inzulin: prvi lijek DNA tehnologije. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.