RESTRIKTIVNI ENZIMI: FUNKCIJE, VRSTE I PRIMJERI - BIOLOGIJA - 2026

A restrikcijski enzimi su korišteni endonukleaze po određenom arheje i bakterija inhibirati ili „ograničiti” širenja virusa unutra. Osobito su česte u bakterijama i dio su njihovog obrambenog sustava protiv strane DNK poznate kao restrikcijski / modifikacijski sustav.

Ti enzimi kataliziraju cijepanje dvopojasne DNA na određenim mjestima, reproduktivno i bez korištenja dodatne energije. Većina zahtjeva prisutnost kofaktora poput magnezija ili drugih dvovalentnih kationa, mada neki zahtijevaju i ATP ili S-adenozil metionin.

Reakcijska shema restrikcijskih enzima HindIII (Izvor: Helixitta putem Wikimedia Commonsa)

Restriktivne endonukleaze otkrili su 1978. Daniel Nathans, Arber Werner i Hamilton Smith, koji su za svoje otkriće dobili Nobelovu nagradu za medicinu. Njihovo ime uglavnom potječe od organizma tamo gdje ih se prvi put promatra.

Takvi se enzimi naširoko koriste u razvoju metoda kloniranja DNA i drugih molekularnih biologija i strategija genetskog inženjeringa. Njihove specifične karakteristike prepoznavanja sekvenci i sposobnost rezanja sekvenci blizu mjesta prepoznavanja čine ih snažnim alatima u genetskom eksperimentu.

Fragmenti nastali restrikcijskim enzimima koji su djelovali na određenu molekulu DNK mogu se upotrijebiti za ponovno stvaranje "mape" izvorne molekule korištenjem podataka o mjestima na kojima je enzim izrezao DNK.

Neki restrikcijski enzimi mogu imati isto mjesto prepoznavanja na DNK, ali ne moraju ih prerezati na isti način. Dakle, postoje enzimi koji sjeku ostavljaju nejasne krajeve i enzimi koji sjeku ostavljaju kohezivne krajeve, a koji imaju različitu primjenu u molekularnoj biologiji.

Trenutno postoje stotine različitih komercijalno dostupnih restrikcijskih enzima koje nude različite trgovačke kuće; Ovi enzimi funkcioniraju kao "prilagođene" molekularne škare za različite svrhe.

Značajke

Restriktivni enzimi ispunjavaju suprotnu funkciju polimeraze, jer hidroliziraju ili prekidaju estersku vezu unutar fosfodiesterske veze između susjednih nukleotida u nukleotidnom lancu.

U molekularnoj biologiji i genetičkom inženjeringu naširoko se koriste alati za izgradnju ekspresijskih i klonirajućih vektora, kao i za identificiranje specifičnih sekvenci. Također su korisni za izgradnju rekombinantnih genoma i imaju veliki biotehnološki potencijal.

Nedavnim napretkom genske terapije trenutačno se koriste restrikcijski enzimi za unošenje određenih gena u vektore koji su prijenosnik takvih gena u žive stanice i koji vjerojatno imaju sposobnost umetanja u stanični genom za obavljanje trajne promjene.

Mehanizam djelovanja

Restriktivni enzimi mogu katalizirati cijepanje dvopojasnog DNA, iako su neki sposobni prepoznati jednopojasne DNK sekvence, pa čak i RNA. Rezanje nastaje nakon prepoznavanja nizova.

Mehanizam djelovanja sastoji se od hidrolize fosfodiesterske veze između fosfatne skupine i deoksiriboze u kosturu svakog lanca DNA. Mnogi enzimi mogu se rezati na istom mestu koje prepoznaju, dok drugi režu između 5 i 9 para para prije ili nakon njega.

Ti se enzimi normalno režu na 5 'kraju fosfatne skupine, dajući fragmente DNA s 5' fosforilnim krajem i 3 'krajnjim hidroksilnim krajem.

Budući da proteini ne dolaze u neposredan kontakt s prepoznatljivim mjestom u DNK, moraju ih se translocirati sukcesivno sve dok se specifično mjesto ne postigne, možda pomoću "kliznih" mehanizama na lancu DNA.

Tijekom enzimskog cijepanja, fosfodiesterska veza svakog od DNA lanaca smještena je unutar jednog od aktivnih mjesta restrikcijskih enzima. Kad enzim napusti mjesto prepoznavanja i cijepanja, to čini putem nespecifičnih prolaznih asocijacija.

vrste

Trenutno je poznato pet vrsta restrikcijskih enzima. Evo kratkog opisa svakog od njih:

Zaštitni enzimi tipa I

Ti su enzimi veliki pentamerni proteini s tri podjedinice, jedna za restrikciju, jedna za metilaciju i jedna za prepoznavanje slijeda u DNK. Ove endonukleze su multifunkcionalni proteini koji mogu katalizirati restriktivne i modifikacijske reakcije, imaju ATPaznu aktivnost i također DNA topoizomerazu.

Enzimi ove vrste bili su prvi otkriveni endonuklezi, prvi su način pročišćeni u 1960-ima i od tada su proučavani u veliku dubinu.

Enzimi tipa I nisu naširoko korišteni kao biotehnološki alat, jer mjesto cijepanja može biti na različitoj udaljenosti do 1.000 baznih parova od mjesta prepoznavanja, što ih čini nepouzdanima u smislu eksperimentalne obnovljivosti.

Zaštitni enzimi tipa II

Oni su enzimi sastavljeni od homodimera ili tetramera koji režu DNK na definiranim mjestima duljine između 4 i 8 bp. Ta mjesta cijepanja su obično palindromna, to jest prepoznaju sekvence koje se čitaju na isti način u oba smjera.

Mnogi restriktivni enzimi tipa II izbacuju DNK kad prepoznaju njegov strani karakter, jer nema tipične modifikacije koje bi trebao imati vlastiti DNK.

Ovo su najjednostavniji restrikcijski enzimi jer za prepoznavanje i rezanje DNK sekvenci ne trebaju nikakav kofaktor osim magnezija (Mg +).

Preciznost restrikcijskih enzima tipa II u prepoznavanju i rezanju jednostavnih sekvenci u DNA na preciznim pozicijama čini ih jednim od najčešće korištenih i neophodnim u većini grana molekularne biologije.

Unutar skupine restrikcijskih enzima tipa II postoji više potklasa razvrstanih prema određenim svojstvima koja su jedinstvena za svakoga. Razvrstavanje ovih enzima vrši se dodavanjem slova abecede, od A do Z prateći naziv enzima.

Neke od podrazreda najpoznatije po korisnosti su:

Podrazred IIA

Oni su dimeri različitih podjedinica. Prepoznaju asimetrične sekvence i koriste se kao idealni prekursori za stvaranje reznih enzima.

Podrazred IIB

Sačinjeni su od jednog ili više dimera i režu DNK s obje strane u prepoznatljivom slijedu. Prerezali su obje lance DNK interval osnovnog para ispred mjesta prepoznavanja.

Podrazred IIC

Enzimi ove vrste su polipeptidi s funkcijama dijeljenja i modifikacije lanca DNA. Ovi enzimi režu obje niti asimetrično.

Podrazred IIE

Enzimi ovog podrazreda se najviše koriste u genetskom inženjerstvu. Imaju katalitičko mjesto i obično zahtijevaju alosterni efektor. Ovi enzimi trebaju međusobno djelovati u dvije kopije svog prepoznavnog slijeda da bi se učinkovito odvojilo. Unutar ovog podrazreda su enzimi EcoRII i EcoRI.

Zaštitni enzimi tipa III

Restrikcijske endonukleze tipa III sastoje se od samo dvije podjedinice, jedna je odgovorna za prepoznavanje i modifikaciju DNK, dok je druga odgovorna za cijepanje sekvenci.

Ti enzimi za svoju funkciju trebaju dva kofaktora: ATP i magnezij. Restriktivni enzimi ove vrste posjeduju dva asimetrična mjesta raspoznavanja, premještaju DNA na ATP-ovisan način i režu ga između 20-30 bp uz mjesto prepoznavanja.

Zaštitni enzimi tipa IV

Enzimi tipa IV lako su identificirani jer sijeku DNK tragovima metilacije, a sastoje se od nekoliko različitih podjedinica koje su odgovorne za prepoznavanje i rezanje DNK sekvence. Ovi enzimi koriste GTP i dvovalentni magnezij kao kofaktore.

Specifična mjesta cijepanja uključuju nukleotidne lance s metiliranim ili hidroksimetiliranim ostacima citozina na jednom ili na oba lanca nukleinskih kiselina.

Zaštitni enzimi tipa V

Ova klasifikacija grupira enzime tipa CRISPER-Cas, koji identificiraju i odrežu specifične sekvence DNA iz organizama koji napadaju. Cas enzimi koriste lanac CRISPER-ovog sintetiziranog vodiča RNA za prepoznavanje i napadanje invazivnih organizama.

Enzimi klasificirani kao tip V su polipeptidi strukturirani prema enzimima tipa I, II i II. Oni mogu rezati dijelove DNA gotovo bilo kojeg organizma i sa širokim rasponom duljine. Njihova fleksibilnost i jednostavna upotreba čine ove enzime jednim od najčešće korištenih alata u genetskom inženjeringu danas, zajedno s enzimima tipa II.

Primjeri

Restriktivni enzimi korišteni su za otkrivanje DNK polimorfizama, posebno u populacijskim genetičkim studijama i evolucijskim studijama pomoću mitohondrijske DNA kako bi se dobili podaci o brzini nukleotidnih supstitucija.

Trenutno vektori koji se koriste za transformaciju bakterija u različite svrhe posjeduju mjesta multikloniranja na kojima se nalaze mjesta prepoznavanja za višestruke restrikcijske enzime.

Među tim enzimima najpopularniji su EcoRI, II, III, IV i V, dobiveni i opisani prvi put iz E. coli; HindIII od H. influenzae i BamHI iz B. amyloliquefaciens.

Reference

1. Bickle, TA, i Kruger, DH (1993). Biologija ograničenja DNA. Mikrobiološki pregledi, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA i Horvath, P. (2007). CRISPR Pruža stečenu otpornost protiv virusa u prokariotima. Znanost, 315 (ožujak), 1709–1713.
3. Goodsell, D. (2002). Molekularna perspektiva: Restriction Endonucleases. Osnove matičnih ćelija u medicini raka, 20, 190–191.
4. Halford, SE (2001). Skakanje, skakanje i petlja pomoću restrikcijskih enzima. Transakcije biokemijskog društva, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). Održavanje identiteta vrsta i kontrola specijalizacije bakterija: nova funkcija za restriktivne / modifikacijske sustave? Gene, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E., i Kilpatrick, S. (2018). Lewinovi geni XII (12 ed.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett učenje.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… Ona, Q. (2015). Upotreba CRISPR-Cas sustava I i III tipa za uređivanje genoma. Istraživanje nukleinskih kiselina, 1–12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Zabranjeni enzimi tipa I i njihova rodbina. Istraživanje nukleinskih kiselina, 1–25.
9. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restrikcija Endonucleases u analizi i restrukturiranju molekula DNA. Annu. Vlč. Biochem., 273–293.
10. Nei, M., i Tajima, F. (1981). DNK polimorfizam koji se može otkriti restrikcijskim endonukleazama. Genetika, 145-163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Stanične i molekularne znanosti o ograničenju Endonukleaze: struktura i mehanizam. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685–707.
12. Roberts, R. (2005). Kako su restrikcijski enzimi postali radni konji molekularne biologije. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Roberts, RJ, i Murray, K. (1976). Ograničenje endonukleaze. Kritički osvrti u biokemiji, (studeni), 123-164.
14. Stoddard, BL (2005). Struktura i funkcija domaćih endonukleaza. Tromjesečni pregledi biofizike, 1–47.
15. Tock, MR, & Dryden, DTF (2005). Biologija restrikcije i anti-restrikcije. Trenutno mišljenje iz mikrobiologije, 8, 466–472.
16. Wilson, GG, i Murray, NE (1991). Ograničenje i izmjene sustava. Annu. Vlč. Genet., 25, 585-627.
17. Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genski uvidi u virulenciju Campylobacter jejuni i populacijsku genetiku. Infec. Dis. Transl. Med., 2 (3), 109–119.
18. Yuan, R. (1981). Struktura i mehanizam višenamjenskih restrikcija. Annu. Vlč. Biochem., 50, 285-315.