ENDONUCLEASES: FUNKCIJE, VRSTE I PRIMJERI - BIOLOGIJA - 2026

Su endonukleaze su enzimi koji rez fosfodiesterskih veza nalazi unutar nukleotidne lanca. Mjesta restrikcije endonukleaze vrlo su raznolika. Neki od tih enzima režu DNK (deoksiribonukleinska kiselina, naš genetski materijal) gotovo bilo gdje, to jest, nisu nespecifični.

Suprotno tome, postoji još jedna skupina endonukleza koje su vrlo specifične u regiji ili nizu koje treba cijepiti. Ova skupina enzima poznata je kao restrikcijski enzimi, a oni su vrlo korisni u molekularnoj biologiji. U ovoj skupini imamo dobro poznate enzime Bam HI, Eco RI i Alu I.

Endonukuze izrezati DNA iznutra.

Izvor: pixabay.com

Suprotno endonukleazama, postoji još jedna vrsta katalitičkih proteina - egzonuklezule - koji su odgovorni za razbijanje fosfodiesterskih veza na kraju lanca.

Ograničenje endonukleaze

Restriktivni endonukleazi ili restrikcijski enzimi katalitički su proteini koji su odgovorni za cijepanje fosfodiesterskih veza unutar DNA lanca u vrlo specifičnim sekvencama.

Ovi enzimi mogu se kupiti od više biotehnoloških tvrtki i njihova je upotreba gotovo nužna u trenutnim tehnikama manipulacije DNK.

Restriktivnim endonukleazama nazivaju se prvim slovima binomnog znanstvenog naziva organizma iz kojeg su poticali, slijede soj (to je neobavezno) i završavaju skupinom restrikcijskih enzima kojima pripadaju. Na primjer, Bam HI i Eco RI se široko koriste endonukleaze.

Područje DNA koje enzim prepoznaje naziva se mjesto restrikcije i jedinstveno je za svaku endonukleazu, iako se nekoliko enzima može podudarati na mjestima restrikcije. Ovo se mjesto obično sastoji od kratkog palindromskog niza duljine oko 4 do 6 baznih parova, poput AGCT (za Alu I) i GAATTC za Eco RI.

Palindromske sekvence su nizovi koji su, iako se čitaju u smjeru 5 'do 3' ili 3 'do 5', identični. Na primjer, u slučaju Eco RI, palindromski niz je: GAATTC i CTTAAG.

Funkcije i primjene restrikcijskih endonkula

Srećom za molekularne biologe, bakterije su tijekom evolucije razvile niz restrikcijskih endonukleaza koje unutarnje dijele genetski materijal.

U prirodi su se ti enzimi razvili - pretpostavlja se - kao bakterijski sustav zaštite od invazije stranih molekula DNA, poput onih iz faga.

Kako bi se razlikovalo nativni i strani genetski materijal, ove restrikcijske endonukleaze mogu prepoznati specifične nukleotidne sekvence. Dakle, DNK koja nema taj slijed može se nesmetano uništiti unutar bakterija.

Suprotno tome, kada endonukleaza prepozna mjesto restrikcije, veže se na DNK i reže ga.

Biologe zanima istraživanje genetskog materijala živih bića. Međutim, DNK se sastoji od nekoliko milijuna baznih parova duljine. Te su molekule izuzetno dugačke i moraju se analizirati u malim fragmentima.

Kako bi se postigao ovaj cilj, restrikcijski endonuklezi integrirani su u različite protokole molekularne biologije. Na primjer, pojedinačni gen može se uhvatiti i ponoviti za buduću analizu. Taj se postupak naziva "kloniranjem" gena.

Polimorfizam dužine ograničenja (RFLP)

Polimorfizmi dužine restriktivnog fragmenta odnose se na obrazac specifičnih nukleotidnih nizova u DNK koje restriktivne endonukleaze mogu prepoznati i smanjiti.

Zahvaljujući specifičnosti enzima, svaki organizam karakterizira specifičan obrazac rezanja u DNK, podrijetlom fragmenti promjenjive dužine.

Vrste restrikcijskih endonukleaza

Povijesno, restrikcijske endonukleaze klasificirane su u tri vrste enzima, označene rimskim brojevima. Nedavno je opisana četvrta vrsta endonukleaze.

Tip I

Najvažnija karakteristika endonukleaze tipa I je da su proteini sastavljeni od nekoliko podjedinica. Svaka od ovih funkcija funkcionira kao kompleks s jednim proteinom i obično ima dvije podjedinice zvane R, dvije M i jednu S.

S dio odgovoran je za prepoznavanje mjesta restrikcije u DNA. Podjedinica R je sa svoje strane bitna za cijepanje i M je odgovoran za kataliziranje reakcije metilacije.

Postoje četiri potkategorije enzima tipa I, poznati po slovima A, B, C i D, koji su u zajedničkoj upotrebi. Ta se klasifikacija temelji na genetskoj komplementaciji.

Enzimi tipa I bili su prva restrikcijska endonukleaza koja je otkrivena i pročišćena. Međutim, u molekularnoj biologiji najkorisniji su tip II koji će biti opisan u sljedećem odjeljku.

Tip II

Endokukleaza tipa II restriktivnim prepoznavanjem specifičnih DNK sekvencija i cijepanjem u konstantnom položaju blizu sekvence koja stvara 5 'fosfata i 3' hidroksila. Obično zahtijevaju magnezijeve ione (Mg ²⁺) kao kofaktore, ali postoje i neki koji imaju puno više specifičnih zahtjeva.

Strukturno se mogu pojaviti u obliku monomera, dimera ili čak tetramera. Rekombinantna tehnologija koristi endonukleaze tipa II i zbog toga je karakterizirano više od 3.500 enzima.

Tip III

Ovi enzimski sustavi sastoje se od dva gena, nazvanih mod i res, koji kodiraju za podjedinice koje prepoznaju DNK i za modifikacije ili ograničenja. Obje su podjedinice neophodne za ograničenje, proces u potpunosti ovisan o hidrolizi ATP-a.

Da bi se cijepila molekula DNA, enzim mora uzajamno djelovati s dvije kopije slijeda ne-palindromskog prepoznavanja i mjesta moraju biti obrnute orijentacije na supstratu. Cepanju prethodi translokacija DNK.

Tip IV

U posljednje vrijeme identificirana je dodatna skupina. Sustav je sastavljen od dva ili više gena koji kodiraju proteine ​​koji cijepaju samo modificirane sekvence DNA, bilo metilirane, hidroksimetilirane ili hidrometilirane glukozile.

Na primjer, enzim EckKMcrBC prepoznaje dva dinukleotida općeg oblika RmC; purin nakon čega slijedi metilirani citozin koji se može razdvojiti s nekoliko para para - od 40 do gotovo 3000. Cijepanje se odvija oko 30 parova baza nakon mjesta koje enzim prepoznaje.

Endonukleaze V

Endonukleze ovog tipa poznate su i kao "napuštanje" endonukleaza. Ti enzimi prepoznaju i režu ciljani slijed DNK na jedinstvenim mjestima u genomu od 14 do 40 bp.

Ti se enzimi kodiraju često u intronima, a vjeruje se da njihova funkcija potiče horizontalni prijenos reznih sekvenci. Nakon rezanja dolazi do popravka prekida u dvostrukoj spirali DNA na temelju komplementarne sekvence.

Primjeri

Endonuclease I iz E. coli djeluje kao obrambeni sustav protiv faga i parazita. Smještena je uglavnom između citoplazmatske membrane i stanične stijenke. To stvara dvolančane prekide u stranoj DNK s kojima djeluje u periplazmatskom prostoru.

CRISPR-Cas endonukleze su enzimi koji djeluju na obrambeni mehanizam mnogih vrsta bakterija. Oni identificiraju i izrezuju specifične sekvence DNA iz invazivnih organizama, koji su uglavnom virusi.

Nedavno su istraživači s Massachusetts Institute of Technology (MIT) otkrili CRISPR-Cas12bm sustav za uređivanje genoma s velikom preciznošću za modifikaciju ljudskih stanica.

Reference

1. Burrell, MM (ur.). (1993). Enzimi molekularne biologije. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA i Wilson, GG (2013). Zabranjeni enzimi tipa I i njihova rodbina. Istraživanje nukleinskih kiselina, 42 (1), 20-44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS, i Pfaller, MA (2017). Medicinska mikrobiologija + StudentConsult na španjolskom + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
4. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restrikcija endonukleaze u analizi i restrukturiranju molekula DNA. Godišnji pregled biokemije, 44 (1), 273-293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Endonukleaza tipa II restrikcije: struktura i mehanizam. Stanične i molekularne znanosti života, 62 (6), 685.