JUHA OD UREE: TEMELJ, PRIPREMA I UPOTREBA - BIOLOGIJA - 2025

Urea iz uree je tekući medij za kulturu, koji se koristi za otkrivanje prisutnosti enzima ureaze u određenim mikroorganizmima. Ureaza je mikrobni enzim koji se proizvodi konstitutivnim načinom, odnosno sintetizira se bez obzira na to ima li supstrat na kojem djeluje ili ne.

Funkcija ureaze povezana je s razgradnjom organskih spojeva. Nisu svi mikroorganizmi sposobni sintetizirati ovaj enzim, stoga njegovo određivanje u laboratoriju omogućuje identificiranje određenih bakterijskih sojeva, pa čak i razlikovanje vrsta istog roda.

Negativni i pozitivni test uree. Izvor: Fotografiju snimio autor MSc. Marielsa Gil.

Postoje dvije vrste testa uree: Stuart i Christensen. Razlikuju se po sastavu i osjetljivosti. Prvi je poseban za prikaz velike količine ureaze proizvedene od vrsta roda Proteus.

Drugi je osjetljiviji i može otkriti male količine ureaze koja kasno nastaje drugim bakterijskim rodovima, poput Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter i Mycobacterium.

Stuart's Urea brod se sastoji od ureje, natrijevog klorida, kalijevog fosfata, monokalijevog fosfata, ekstrakta kvasca, fenola crvene i destilirane vode.

U međuvremenu, Christensen-ov urea ili agar sačinjavaju peptoni, natrijev klorid, monokalijev fosfat, glukoza, urea, fenol crvena, destilirana voda i agar-agar. Potonji samo ako je čvrsti medij.

osnova

Enzim ureaza hidrolizira ureu, stvarajući ugljični dioksid, vodu i dvije molekule amonijaka. Ti spojevi reagiraju i formiraju krajnji produkt nazvan amonijev karbonat.

Stuartov brod za ureu

Stuartov juha od uree puferira se s pH od 6,8. Stoga mikroorganizam mora biti u stanju formirati velike količine amonijaka da bi fenol postao crven. PH bi trebao porasti iznad 8.

Prema tome, Stuart-ov urea iz juhe selektivan je za vrste Proteus, dajući pozitivne rezultate unutar 24 do 48 sati inkubacije, i nije učinkovit za bakterije koje stvaraju male količine ureaze ili koje ureaju sporo hidroliziraju.

To je zato što su vrste Proteus sposobne koristiti ureu kao izvor dušika. Umjesto toga, drugim bakterijama koje proizvode ureazu potreban je dodatni izvor.

Međutim, Pérez i sur. (2002) utvrdili su da je Stuart-ov bujon uree jednako učinkovit kao Christensenov urea za određivanje ureaze u sojevima kvasca roda Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon i Saccharomyces.

Autori studije tvrde da su postigli 100% -tni dogovor s oba medija (Stuart i Christensen) prilikom inkubacije u trajanju od 24 do 48 sati; s izuzetkom što su sojevi koji su uspjeli medij pretvoriti u jaku ružičasto-fuksionu boju uzeli kao pozitivni.

Ovo je pojašnjenje potrebno jer je Lodder (1970.) izjavio da gotovo svi kvasci uspijevaju pretvoriti Christensen-ov agar sa zubu u blijedo ružičastu. To je zbog činjenice da oni mogu hidrolizirati ureu u minimalnim količinama, te stvaranja amina oksidacijskom dekarboksilacijom aminokiselina na površini. To se ne smije tumačiti kao pozitivno.

Christensenov Urea Agar ili broth

Christensen-ov bujon ili agar s ureom manje su puferirani i mogu otkriti male količine amonijaka. Nadalje, ovaj medij je obogaćen peptonovima i glukozom. Ti spojevi uzrokuju rast drugih mikroorganizama koji stvaraju ureazu koji ne rastu u juhu Stuart.

Isto tako, Christensen test uree nudi brže rezultate, posebno za Proteus, jer može dati snažno pozitivne rezultate u samo 30 minuta kao minimalno vrijeme i do 6 sati kao maksimalno vrijeme.

Ostali mikroorganizmi koji proizvode ureazu uspijevaju malo okrenuti boju medija nakon 6 sati, a snažno nakon 24, 48, 72 sata ili više, pa čak i neki sojevi mogu dati slabe reakcije nakon 5 ili 6 dana.

Tumačenje oba medija (Stuart i Christensen)

Medij je izvorno žuto-narančaste boje i pozitivna reakcija će boju medija pretvoriti u ružičasto-fuksiju. Intenzitet boje izravno je proporcionalan proizvedenoj količini amonijaka.

Negativna reakcija ostavit će medij prvobitne boje s izuzetkom kvasca koji se na Christensenovom agarskom agaru može pretvoriti u blijedo ružičastu boju.

priprema

Stuartov brod za ureu

Vagati grame prema naznakama komercijalnog poduzeća. Otopiti u poželjno sterilnoj destiliranoj vodi. Ne koristite toplinu za otapanje, jer je ureja osjetljiva na toplinu.

Membranska filtracija koristi se za sterilizaciju. Za to se koristi Millipore filter s porama promjera 0,45 µ. Ne koristite autoklav. Jednom kada se otopina filtrira, ona se distribuira u sterilne epruvete. Da bi se dobili pouzdani rezultati, minimalnu količinu od 1,5 ml treba prenijeti na maksimalnu količinu od 3 ml po epruveti.

Prije upotrebe čuvajte u hladnjaku i zagrijte.

Ako metoda filtracije nije dostupna, medij treba odmah upotrijebiti za postizanje pouzdanih rezultata.

Drugi način pripreme Stuartovog juha od ureje je sljedeći:

Neke komercijalne kuće prodaju osnovni medij za ispitivanje uree, ne uključujući ureu.

Količina koja je navedena u komercijalnom društvu izvaže se. Otapa se u destiliranoj vodi i sterilizira u autoklavu na 121 ° C tokom 15 minuta. Ostavljeno je da se malo odmori, a kad je medij topao, dodajte 100 ml otopine uree pripremljene na 20% i sterilizirajte filtriranjem.

Distribuira se u sterilnim epruvetama, kao što je prethodno opisano.

Christensenov Urea Agar ili broth

-Priprema otopine uree

Odmjeriti 29 g dehidrirane uree i otopiti u 100 ml destilirane vode. Za sterilizaciju koristite metodu filtracije. Ne autoklavirajte.

-Ugar bazni agar

Otopite 24 g dehidriranog baznog agara u 950 ml destilirane vode. Sterilizirajte u autoklavu na 121 ° C 15 minuta. Ostavite da odmara dok ne dosegne temperaturu od 50 ° C i dodajte prethodno pripremljenu ureu aseptično.

Ulijte 4-5 ml u sterilne epruvete i nagnite dok se ne očvrsne. Trebao bi biti dugačak kljun flaute.

Ovaj medij se može pripremiti i u tekućem obliku.

Prijave

Urea test je izuzetno učinkovit u razlikovanju roda Proteus od ostalih rodova u obitelji Enterobacteriaceae, s obzirom na brzu reakciju koju pruža Proteus.

Korištenjem Christensen sastava, test pomaže razlikovati vrste istog roda. Na primjer, S. haemolyticus i S. warneri su koagulazno negativni i beta-hemolitički stafilokok, ali se razlikuju po tome što je S. heemolyticus urea negativan, a S. warneri pozitivan urea.

S druge strane, McNulty uspješno je koristio Christensen-ov 2% -tni urea za proučavanje prisutnosti Helicobacter pylori u uzorcima biopsije uzetih iz želučane sluznice (antralna regija).

Prisutnost H. pylori dokazuje pozitivnim testom uree. Vrijeme praćenja rezultata izravno je proporcionalno količini mikroorganizama koji su prisutni.

Kao što se može vidjeti, to je jednostavna metoda dijagnoze Helicobacter pylori u želučanim biopsijama.

I na kraju, ovaj test je također koristan za razlikovanje vrsta iz rodova Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus i Mycobacteria.

Sjetva testa uree

Obje metode zahtijevaju snažan mikrobni inokulum kako bi se optimizirali rezultati. Kolonije bakterija uzimaju se ponajprije iz krvnog agara, a kvasci iz Sabouraudovog agara, s nekoliko izuzetaka. Inokulum se emulgira u tekućem mediju.

Za Stuartov jušni ureaj inkubirajte 24 do 48 sati na 37 ° C, znajući da tražite sojeve Proteusa samo kada je soj bakterija. Za kvasce se može inkubirati na 37 ° C ili na sobnoj temperaturi tijekom 24 do 48 sati inkubacije.

U slučaju Christensenove juhe, ureza se inkubira 24 sata na 37 ° C. Ako je test negativan, može se inkubirati najviše 6 dana. Ako je test pozitivan prije 6 sati, to znači da je riječ o soju roda Proteus.

U slučaju Christensenovog agara s urezom, nagib agara snažno se inokulira, bez probijanja. Juha se inkubira i tumači na isti način.

QA

Za ispitivanje medija mogu se koristiti kontrolni sojevi poput Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 i Salmonella typhimurium. Prve dvije trebaju dati pozitivne rezultate, a posljednje dvije negativne rezultate.

Izvor: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.

Reference

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. i sur. Upotreba Stuart-ovog čira iz uree za test ureaze, kao test u dijagnozi kvasca. Vlč. Microhiol. 2002; 22 (2): 136-140. Dostupno na: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Biokemijski testovi za identifikaciju bakterija kliničkog značaja. 3. izd. Uredništvo Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiološka dijagnoza. 12 ed. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
5. Britannia Laboratories. Christensen Medium (agar baza urea) 2015. Dostupno na: britanialab.com