FOSFATNI PUFER (PBS): OBRAZLOŽENJE, PRIPREMA I UPOTREBA - BIOLOGIJA - 2026

Fosfatni pufer, fosfatni pufer i otopina soli ili BPS je pufer izotonična, čija funkcija je da održavanje pH i osmotski tlak kao blizu prirodnom biološkom okruženju (fiziološkog). Akronim PBS znači fiziološka otopina puferirana fosfatima.

PH i osmolarnost su dva vrlo važna aspekta koja se moraju kontrolirati u određenim laboratorijskim protokolima. U slučaju pH, bitno je kontrolirati ga, posebno u biokemijskim reakcijama, jer se one mogu razlikovati ili se ne mogu provesti ako su reaktanti na neprikladnom pH.

PBS fosfatna puferirana fiziološka otopina kod dva različita pH. Izvor: Pixinio.com

U međuvremenu je kontrola osmolarnosti ključna, osobito u radu s živim stanicama, budući da plazma membrane stanica reagiraju u skladu s koncentracijom otopljenih tvari u kojima se nalaze.

Ako se stanice prebace u hipertonični medij, postat će dehidrirani, budući da će se gradijent vode prevesti na stranu gdje je veća koncentracija topljenih tvari. Ako se, naprotiv, stanice stave u hipotonični medij, stanice će apsorbirati tekućinu dok se ne liziraju.

Zbog toga se PBS pufer koristi za laboratorijske protokole koji zahtijevaju održavanje stanica in vitro, na taj način stanice neće biti oštećene.

PBS se sastoji od kombinacije soli, poput natrijevog klorida, natrijevog fosfata, kalijevog klorida i kalijevog fosfata. Sastav PBS-a može varirati ovisno o protokolu.

osnova

Funkcija fosfatnog pufera je u osnovi održavanje konstantnog fiziološkog pH zajedno s koncentracijom elektrolita sličnom onoj koja se nalazi u tijelu.

U tom su okruženju stanice sposobne ostati stabilne jer su fiziološki uvjeti simulirani u što većem broju.

Ostali spojevi mogu se dodati originalnoj formulaciji PBS-a ako je potrebno, na primjer, dodavanje EDTA puferu je korisno za ispiranje crvenih krvnih stanica u testu unakrsne nespojivosti.

EDTA sprečava da se frakcija komplementa C1 prisutna u serumu odvoji i lizira crvene krvne stanice, tj. Izbjegava lažne rezultate nespojivosti. Pored toga, EDTA pomaže u disocijaciji stanica.

priprema

Količina soli koja se mora izvagati za pripremu fiziološke otopine puferirane PBS fosfatom ovisit će o količini koja se mora pripremiti:

-Slana otopina puferirana fosfatima (10X PBS)

Za jednu litru otopine:

Težiti:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCl, 11,5 g Na ₂ HPO ₄, 2,0 g KH ₂ HPO ₄

Tehnika pripreme

Stavite teške soli u čašu, dodajte dovoljno vode (80%) i miješajte na ploči za miješanje s magnetskom trakom dok se soli ne otope.

Priprema PBS-a primjenom miješajuće ploče s magnetskom šipkom. Izvor: Korisnik: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtrirajte kako biste uklonili neraztopljene čestice. Upotrijebite filtre s porama od 0,45 µm. Autoklavirajte i aseptično rasporedite u poklopcu za laminarni protok u staklenim posudama s poklopcima.

10X otopina (koncentrirana) ne prilagođava pH. Prilagođavanje se vrši nakon razrjeđivanja do 1X koncentracije PBS pufera (razrjeđivanje 1:10).

-Bufer fosfatna fiziološka otopina (1X PBS)

1X PBS može se pripremiti izravno, odvažujući odgovarajuće količine svake soli, ili se može pripremiti razrjeđivanjem osnovne otopine (1:10) sterilnom destiliranom vodom.

-Da biste izravno pripremili jednu litru fiziološke otopine punjene 1X PBS fosfatom, izvažite:

8,06 g NaCl, 0,22 g KCl, 1,15 g Na ₂ HPO ₄, 0,20 g KH ₂ HPO ₄

Tehnika pripreme

Postupak kako je objašnjeno u koncentriranoj otopini. Nakon toga pH se mora prilagoditi. Da biste to učinili, izmjerite pH i ovisno o rezultatu koristite kiselinu (HCl) ili bazu (NaOH) da biste po potrebi snizili ili povisili pH, sve dok ne postane 7.4.

Kiselina ili baza dodaju se kap po kap uz praćenje pH vrijednosti otopine pomoću pH metra. Filtrirajte, autoklavite i po potrebi aseptično rasporedite u stožaste epruvete ili staklenke.

-Pripremiti 1X PBS iz 10X osnovnog rješenja:

Napravite razrjeđenje od 1:10. Na primjer, za pripremu 1 litre 1X PBS-a odmjerite 100 ml osnovne otopine i dodajte 700 ml sterilne destilirane vode. Podesite pH i napunite količinu vode do 1000 ml.

Pripremljeni PBS pufer je bezbojan i bistr.

Dnevni PBS mogu se čuvati na sobnoj temperaturi, a ostatak u hladnjaku.

Rješenja za podešavanje pH

HCl

Za 100 ml 1 molarne HCL (klorovodična kiselina).

Izmjerite 91 ml destilirane vode i stavite je u čašu od 250 ml.

Izmjerite 8,62 ml koncentrirane HCl i polako je dodajte u čašu koja sadrži vodu (nikad ne činite obrnuto). Poduzmite odgovarajuće mjere biološke sigurnosti prilikom rukovanja s jakim kiselinama (jako korozivna tvar).

Miješajte 5 minuta, poželjno pomoću ploče za miješanje s magnetskom trakom unutar čaše. Transfer ml tikvicu od 100 i čine do 100 ml s destiliranom H ₂ O.

NaOH

Za 100 ml NaOH (natrijev hidroksid) 10 mola.

Izmjerite 40 ml destilirane vode i stavite je u čašu od 250 ml. Izmjerite 40 g NaOH i dodajte u vodu. Pomiješajte pomoću ploče za miješanje s magnetskom trakom unutar čaše.

Prebaciti u volumensku tikvicu od 100 ml i nadopuniti do oznake destiliranom vodom. Pridržavajte se propisa o biološkoj sigurnosti jer je ova reakcija egzotermna (oslobađa energiju u obliku topline).

Ako želite pripremiti druge količine fiziološke fiziološke otopine, možete potražiti sljedeću tablicu:

Izvor: «Laboratorij za virusnu i humanu genomiju, Medicinski fakultet UASLP»

Prijave

Primarno se koristi u staničnoj biologiji, imunologiji, imunohistokemiji, bakteriologiji, virologiji i istraživačkim laboratorijima.

Idealan je za ispiranje stanica centrifugiranjem (crvenih krvnih zrnaca), ispiranjem mono-slojeva stanica, u tehnikama spektroskopske elipsometrije, u kvantifikaciji bakterijskih biofilma, u održavanju staničnih kultura za viruse, kao sredstvo za ispiranje u tehnici neizravne imunofluorescencije. te u tehnikama za karakterizaciju monoklonskih antitijela.

Koristi se i za transport stanica ili tkiva, kao razrjeđivač za brojanje stanica, pripravu staničnih enzima (tripsin), kao razrjeđivač za metodu sušenja biomolekula i za pripremu drugih reagensa.

S druge strane, Martin i suradnici su 2006. pokazali da je PBS koristan u forenzičkim laboratorijima, posebno u obnavljanju sperme iz vaginalnih mrlja ili u obnavljanju vaginalnih stanica od brisa penisa. Na taj se način može utvrditi postoji li seksualni odnos.

Ograničenja

-Neki PBS puferi sadrže tvar koja se naziva natrijev azid kao konzervans. Ovaj spoj može stvoriti eksplozivne tvari ako dođe u kontakt s olovom ili bakrom. Iz tog razloga, morate paziti na poseban oprez pri odlaganju ovog reagensa kroz odvod. Ako se na ovaj način odbaci, mora se dodati puno vode da se razrijedi što je više moguće.

-Cink se ne smije dodati fosfatnom puferu, jer on izaziva talog nekih soli.

-Wangen i suradnici u 2018. utvrdili su da upotreba PBS-a nije prikladna za pranje primarnih stanica akutne mijeloidne leukemije (AML) izvađenih iz periferne krvi, zbog činjenice da su mnoge stanice izgubljene lizijom, uz veliko smanjenje materijala protein.

Stoga su utvrdili da se primarne AML stanice ne smiju oprati PBS-om nakon skladištenja u tekućem dušiku.

Reference

1. Coll J. (1993). Dijagnostičke tehnike u virologiji. Ed Díaz de Santos. 360 pg
2. Rodríguez M, Ortiz T. Stanična kultura. Promjena medija. Odjel za normalnu i patološku citologiju i histologiju Sveučilišta u Sevilli. Dostupno na personal.us.es
3. Priprema fiziološke otopine puferirane fosfatom (PBS). (2008). Standardni operativni postupci (SOP) Laboratorija za humanu i virusnu genomiku UASLP Medicinski fakultet. Dostupno na: genomica.uaslp.mx
4. "Fiziološka otopina fosfatne otopine." Wikipedia, Slobodna enciklopedija. 3 tra 2019, 19:36 UTC 13 travanj 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Teme iz molekularne biofizike. Dostupno na: users.df.uba.ar
6. Rediar. Priručnik. PBS + EDTA. Dostupno na: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Upotreba puferirane fosfatnom fiziološkom otopinom za oporavak stanica i spermatozoida iz brisa. Znanost pravde. 2006; 46 (3): 179-84. Dostupno na: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A i sur. Način očuvanja i ispiranje fiziološkom otopinom s fosfatom utječu na akutni mijeloidni leukemijski proteom. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Dostupno na: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Teorijski i praktični temelji histokemije. Vrhovno vijeće za znanstvena istraživanja. Madrid. Dostupno na: books.google.co.ve