NEGATIVNO BOJENJE: OBRAZLOŽENJE, TEHNIKA, PREDNOSTI I NEDOSTACI - BIOLOGIJA - 2025

Negativna bojenje je postupak za posebne boje za označavanje prisutnost kapsule u nekim mikroorganizama, uglavnom Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae i Cryptococcus neoformans-, iz kliničkih uzoraka, odnosno kao čisti kulturama.

Izravni uzorak koji se obično koristi za nanošenje negativnog bojenja je cerebrospinalna tekućina. Ova tehnika predstavlja brzu alternativu za pretpostavljenu dijagnozu meningitisa, posebno Cryptococcus neoformans.

A. Zubni kamenac obojen indijskom tintom, B. Cryptococcus neoformans var gatti slabo je inkapsuliran kao što se događa u prirodi, koristeći nigrosin. C. Cryptococcus neoformans var gatti s gustom kapsulom koja se nalazi u njegovom parazitskom obliku, koristeći nigrosin. D. Cryptococcus neoformans s malo razrijeđenom indijskom tintom. Gisell Quinde, iz Wikimedia Commons / CDC, putem Wikimedia Commons / Fotograf: Ponuditelji sadržaja: CDC / Dr. Leanor Haley, putem Wikimedia Commonsa

Isto tako, ta se mrlja može primijeniti na ispljuvak i sterilne tekućine općenito, kao i na sojeve dobivene iz mladih čistih kultura. Ova tehnika koristi nigrosin ili indijsku tintu za svoje izvršavanje; stoga je primjena vrlo jednostavne i jeftine metodologije koja u kratkom vremenu pruža informacije od velike dijagnostičke vrijednosti.

U tom smislu, svaki laboratorij je sposoban izvesti to bojenje. Naravno, laboratorij mora imati kompetentno osoblje sposobno prepoznati izolirane ili pupoljane Cryptococcus neoformans kvasce i razlikovati ih od leukocita i artefakata koje uzorak može imati.

osnova

Nigrosin i indijska tinta djeluju na sličan način; stoga se bilo koja od dviju tvari može koristiti na isti način.

Ova se tehnika naziva negativno bojenje, jer djeluje suprotno od ostalih tehnika bojenja. Pri tome je ono što ostaje neizgrađeno: struktura koja se traži ili koju se želi vidjeti; odnosno mikroorganizmi.

Stoga se bojenje temelji na bojenju dna mrlje tamnom bojom. U ovom će se slučaju kapsulirane strukture istaknuti svijetlom ili bezbojnom bojom.

Općenito, kvasci su refleksni, okruženi bistrim haloom koji odgovara kapsuli. To se događa jer indijska tinta i nigrosin su tvari koje ne mogu prodrijeti u polisaharid koji čini kapsulu živih mikroorganizama.

Vrijedno je napomenuti da druge strukture koje mogu biti prisutne u izravnom uzorku, poput leukocita ili crvenih krvnih zrnaca, ne prodiru ni u jednu.

Međutim, ako su mikroorganizmi mrtvi, boja može prodrijeti unutar njih, tako da je i ovo obojenje korisno za procjenu održivosti mikroorganizama.

Tehnika

materijali

Nigrosine

Nigrosin duguje svoje ime crnoj boji koju ima. To je sintetička tvar koja se dobiva zagrijavanjem mješavine organskih spojeva - takvih kao nitrobenzin, anilin i anilin hidroklorit - upotrebom katalizatora (željeza ili bakra) u navedenoj reakciji.

Kineska tinta

Kineska tinta tvar je koju uglavnom koriste Azijci za pisanje, stvaranje umjetničkih djela i jednobojno slikanje. Vrlo je popularan u kineskoj kulturi.

Dobiva se iz tinte lignje pomiješane s prahom ugljena, proizvod spaljivanja stabala sa niskom smolom.

Moguće ga je pripremiti i od čađe iz spaljivanja ugljikovodika (biljnih ulja), zajedno s proteinskom želatinom koja mu daje pravu konzistenciju kako bi se izbjeglo taloženje čestica ugljika.

Specifikacije za uzorkovanje

- Ne zahtijeva post.

- CSF, ispljuvak ili sterilni tekući uzorak moraju sadržavati najmanje 1 ml volumena i odmah se moraju prenijeti u laboratorij na sobnoj temperaturi.

- CSF i sterilne uzorke tekućine mora uzeti specijalizirani liječnik.

- To može biti i čista kultura sumnjivog soja povezanog s spomenutim patogenima.

Izvođenje tehnike s izravnim uzorcima

- Uzorci se moraju centrifugirati, zatim se supernatant odbaci i uzme talog.

- Kap centrifugiranog materijala (sedimenta) i kap indijske tinte ili nigrosina stave se na čisti tobogan.

- Treba ga dobro izmiješati i prekriti pokrivačem, čime će se kap širiti kao tanki film bez prelaska preko ivica.

- Nakon toga pripravak je montiran na mikroskopu.

- Ako je pripravak previše taman, može se razrijediti vodom.

Izvođenje tehnike sa sojevima iz kulture

- Vrlo mali dio mlade kulture uzima se iglom za sjetvu i otopi u kapljici indijske tinte prethodno stavljenu na čistu toboganu.

- Pokrivač se postavlja na vrh.

- U mikroskopu se opaža u 10X, a zatim u 40X.

Dio kolonije možete otopiti i u destiliranoj vodi, a odatle popijte kapljicu i pomiješajte je sa indijskom tintom. Na taj način, preparat neće biti toliko gust, što će omogućiti promatranje struktura u izolaciji; ako ima gužve, neće se dobro primijetiti.

Druga metodologija je sljedeća:

- Stavite kap kulture suspenzije na jedan kraj klizača.

- Na isti kraj stavite kap nigrosina i promiješajte.

- Pomoću drugog tobogana širite uzorak kao da napravite hematološki bris.

- Ostavite da se osuši i promatrajte pod mikroskopom.

Promatranje mikroskopa

Najprije se morate fokusirati s ciljem 10X kako biste imali široki prikaz polja. Nakon toga treba potražiti postoje li jasni razmaci; ako ih ima, fokusirajte 40X da biste vidjeli detalje.

Prednost

- Jednostavno se izvršava.

- To je jeftina tehnika.

- Ova metoda ne zahtijeva da se razmaz fiksira na toplinu ili s kemikalijama; stoga se mikroorganizmi promatraju bez izobličenja.

- Svježi pripravak ne treba sušiti, pa ga možete uočiti odmah, brzo stvarajući rezultate.

Hendikep

Jednom sastavljeni svježi pripravci moraju se odmah promatrati; ako se ostave da se osuše, više ih nije moguće promatrati i mora se postaviti nova.

Bojenje tkiva tintom u Indiji

Druga funkcija koju indijska tinta može ispuniti je u patološkim laboratorijima. Ovo se primjenjuje na kirurški izvađenim uzorcima tkiva kako bi se označile resekcijske margine tumora.

Označeno tkivo prska se octenom kiselinom. To djeluje kao mordant i sprječava istjecanje tinte kada se tkivo podvrgne rutinskoj obradi za pripravak za biopsiju.

Postupak se sastoji od kupanja tkiva u alkoholu i ksilelu, a zatim namočenjem u parafinski vosak. Ovo označavanje vodi patologa kad promatra tkivo, naznačavajući gdje je kirurška granica resekcije ili drugo zanimljivo mjesto.

Reference

1. «Nigrosina». Wikipedia, Slobodna enciklopedija. 11. srpnja 2017., 22:46 UTC 6. siječnja 2019., 16:56: en.wikipedia.org
2. "Kineska tinta". Wikipedia, Slobodna enciklopedija. 1 listopad 2018, 03:08 UTC. 6. siječnja 2019., 18:20: es.wikipedia.org/
3. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J i suradnici. (2006). Laburističko osoblje autonomne zajednice Extremadura. Specifični dnevni red Svezak IV. Uredništvo MAD. Seville-Spain, pp 211-212.
4. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006.) Specijalistički laboratorijski tehničar, Galicijska zdravstvena služba (SERGAS). Posebni svezak dnevnog reda 2. Uredništvo MAD. Sevilja-Španjolska, str. 79-80.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiološka dijagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Uredništvo Panamericana SA