WRIGHTOVA MRLJA: OBRAZLOŽENJE, MATERIJALI, TEHNIKA I UPOTREBA - BIOLOGIJA - 2026

Wright mrlja je bojenje tehnika stvorio američki patolog James Homer Wright 1902., na temelju Romanowsky mrlju. Budući da je Romanowsky mrlja bila nestabilna, Wright je metanol uključio kao otapalo i učvršćivač.

Ovo je bojanje polikromno, što znači da stvara nekoliko boja, ovisno o strukturi koja apsorbira boju. Ova tehnika bojenja široko se koristi za obavljanje diferencijalnog broja bijelih krvnih stanica i za proučavanje morfologije crvenih krvnih stanica, trombocita i leukocita u perifernoj krvi i koštanoj srži.

Različite periferne mrlje krvi obojene Wright-ovom mrljama. A. Akutna leukemija B. Plasmodium vivax unutar eritrocita. C. Plasmodium falciparum, makrogetocit. D. limfocita

Njegova je primjena vrlo važna, jer se nepravilnosti mogu uočiti u različitim staničnim linijama krvi, što olakšava dijagnozu bolesti poput leukemije ili bakterijskih ili parazitskih infekcija.

Možda su to najčešće aplikacije u kojima se ova tehnika koristi, no one nisu jedine. Korisna je i u uzorcima koji nisu iz krvi i koštane srži, poput iscjedaka iz nosa, fekalne sluzi, ispljuvaka, uzoraka kože, između ostalih.

Obrazloženje Wrightove mrlje

Wrightova mrlja nastala je od Romanowskog mrlje koja se sastoji od metil-alkoholne otopine kiselog bojila (eozin Y) i osnovnog bojila (metilen plave boje) i njihovih proizvoda oksidacije.

Mješavina boja koja se koristi u Wrightovoj mrlji uzrokuje efekt poznat kao Romanowsky, odnosno daje lijepu ljubičastu boju jezgrama leukocita i neutrofilnih granula, dok crvene krvne stanice ostaju ružičasto.

Komponente odgovorne za dobivanje tipične boje boja Wrightove mrlje su plava B i eozin Y. Promatrani učinak ovisit će o vezanju bojila na kemijske strukture i interakciji plavog B i eozina Y.

Kisele strukture poput nukleinskih kiselina, nuklearnih proteina i reaktivna nezrela citoplazma nekih tipova stanica popravljaju plavu B (osnovnu mrlju).

Dok osnovne strukture poput hemoglobina, granule segmentiranog eozinofila, među ostalim stanične strukture, vežu eozin Y (kiselo bojilo).

Na rezultat bojenja mogu utjecati različiti čimbenici, poput pH boje Wright, pufera i otopine za pranje; kao i vrijeme bojenja i fiksacije.

Stoga je svaki korak u pripremi reagensa presudan i mora se izvesti s pažnjom na svaki detalj.

materijali

Wright je mrlja. Za 100 ml potrebno je:

Odmjerite 0,3 g Wright-ove mrlje, odmjerite 97 ml metanola i 3 ml glicerola.

priprema

Stavite veliku količinu Wrightove mrlje u malter i postepeno dodajte glicerol dok se prašak potpuno ne otopi.

Nakon toga se doda metanol, pomiješa i prelije u ambernu bocu.

Prije upotrebe, otopinu je potrebno mućkati nježnim pokretima i filtrirati.

Puferirana otopina pufera

U jednoj litri destilirane vode, 3,76 g dinatrij hidrofosfat (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) plus 2,1 g kalijevog fosfata dihidrogen (KH ₂ PO ₄ doda se).

Vrlo dobro miješajte dok se svi ugrađeni reagensi ne otope. Podesite pH na 7,2. Sipati u staklenu teglu i držati na sobnoj temperaturi.

Dodatni materijali potrebni za obavljanje bojanja

Pored toga, potrebni su i drugi materijali kako bi se mogla provoditi tehnika bojanja, a to su: predmetni tobogan ili prekrivači, most za bojenje, majice s vodom ili tampon za pranje, štoperica za održavanje vremena bojanja i nešto sušenog materijala (upijajući papir, gaza ili pamuk).

Dijelovi Wrightove mrlje

metanol

Alkohol (metanol) služi kao fiksativ razmaza krvi na slajd.

To je u osnovi koagulant koji smanjuje, dehidrira i učvršćuje reagens. Stoga je njegova funkcija koagulirati proteine ​​i učiniti ih netopljivim, ali bez da ih zapravo denaturira.

Metanol je najčešće korišteni reagens za fiksiranje razmaza u svim laboratorijima, jer daje bolje rezultate od etanola. Idealna koncentracija je 99%.

prigušivač

Pufer (puferirana otopina) ima funkciju podešavanja ili održavanja pH boje, jer je pH prilagođen na 7,2 neophodan za stanične strukture da mogu pravilno apsorbirati boje.

S druge strane, korak fiksacije metanola dehidrira stanice i pufer pomaže u njihovoj rehidrataciji.

Eosin (Y)

Eosin ima afinitet prema građevnim blokovima jer je to kiselo bojilo. Poznate su dvije vrste eozina vrlo slične jedna drugoj, toliko da se bilo koja od njih može koristiti, a da se dobije isti rezultat.

Jedan se naziva eozin Y, žuti eozin ili tetrabromofluorescein, a drugi se naziva eozin B, plavkast eritrosin B ili dibromodinitrofluorescein. Međutim, eozin Y se najčešće koristi.

Najvažnije svojstvo ove boje je njegova negativna polarnost, zbog čega privlači pozitivno nabijene stanične strukture.

Metilen plava

Osnovno je bojanje. Njegovo glavno svojstvo je metakromasija, to jest, neće sve strukture biti obojene istom bojom, to ovisi o kemijskom sastavu struktura koje se obojavaju.

Neki će se pretvoriti u svijetlo ili tamno plavu, a neki će se pretvoriti u tamno ljubičastu ili blijedo ljubičastu.

Tehnika

1 - Izvršite širenje uzorka tako da ostane tanak film na klizaču ili na poklopcu.

2 - Ostavite da se suši na zraku otprilike 2 sata.

3 - Stavite suhi razmaz na most za bojenje ili ladicu za bojenje tako da uzorak bude širen prema gore.

4 Pokrijte list Wright mrlje kap po kap dok se ne prekriva cijela površina. Ostavite 5 - 8 minuta.

5-mrlja bi trebala potpuno prekriti tobogan, bez prolijevanja po rubovima. Ako tijekom vremena bojanja počne isparavati, dodajte nekoliko dodatnih kapi.

6-Zatim dodajte jednaku količinu amortizera, malo probušite dok se ne pojavi karakteristični metalni sjaj. Vrijeme 10 do 15 minuta.

7-Operite vodom iz slavine, stavljajući nježni tok sve dok plahta ne postane ružičasta.

8 - Pomoću gaze natopljene u alkoholu uklonite boju zalijepljenu na stražnjoj strani klizača.

9 Ostavite da se razmaz dobro osuši prije stavljanja uranjajućeg ulja da biste ga pogledali pod mikroskopom.

Korisnost

Hematologija

Idealna je za bojenje perifernih mrlja krvi, za ispitivanje gustih mrlja krvi i za proučavanje stanica iz uzoraka koštane srži.

Zbog kemijskih svojstava ove kombinacije boja, stanične se strukture lako prepoznaju, a mogu se razlikovati različite vrste prisutnih stanica.

Nosivost

Ova je tehnika vrlo korisna za identificiranje stanica nosnog pražnjenja (epitelne stanice, segmentirani eozinofili, polimorfonuklearne stanice) u dijagnozi alergijskog rinitisa.

parazitologija

U tom je smislu korisno za ispitivanje Leishmania sp unutar histiocita potkožnog staničnog tkiva u kožnim čirima. Isto tako, koristi se za identificiranje leukocita u uzorcima stolice (fekalni leukogram).

U ovom slučaju, liječniku je zanimljivo znati je li leukocitoza prisutna u stolici polimorfonuklearna ili mononuklearna. Ovaj nalaz u fekalnom leukogramu uputit će se radi li se o bakterijskoj ili virusnoj infekciji.

S druge strane, paraziti koji cirkuliraju u krvi mogu se naći unutar eritrocita ili slobodni u plazmi. Traženi paraziti su Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii i filarias, a u veterinarskoj medicini korisno je u potrazi za Theileria equi i Babesia caballi, uzročnicima bebesioze, osobito kod konja.

Wright mrlja, a također i mrlja od Giemsa, omogućuju razlikovanje hemoparazita od normalnih staničnih komponenti. Za to se mogu koristiti dvije vrste namaza:

Širite tanko

Krv se širi kao tanki film na toboganu. Bojena je Wright-ovom mrljom, otkrivajući karakteristike jezgre i citoplazme.

Gusta kap

Ova se metodologija koristi za ispitivanje prisutnosti parazita u većoj količini krvi.

Da biste to učinili, velika kapljica krvi stavi se na tobogan. Kad se stigne, mora se defibrilirati, čineći sve veće i veće krugove od sredine prema van, koristeći rub drugog klizača.

Konačno, da biste mogli opažati parazite u gustom razmazu, eritrociti se moraju lizirati vodom.

Respiratorne infekcije

Na respiratornoj razini ova je tehnika također korisna jer su stanice prisutne u uzorcima sputuma, ispiranja bronha ili bronhoalveolara važne za postavljanje dijagnoze.

Slično, ovdje se mogu razlikovati polimorfonuklearne stanice i mononuklearne stanice.

bakteriologija

Upotreba ove tehnike u bakteriologiji je ograničena, jer nije dobra za bojenje bakterija, zbog čega se za njihovo bojenje koriste druge specijalizirane tehnike bojenja.

Međutim, korištena je za traženje epitelnih stanica s tijelima za uključivanje Chlamydia trachomatis u brise sluznice uretre ili endocervikalne sluznice, iako se mora shvatiti da to nije najbolja metoda za to.

Također je moguće opaziti spiralno slične bakterije kao što je Borrelia burgdorferi među crvenim krvnim stanicama zaraženih bolesnika, kao i morule ili inkluzijska tijela Ehrlichia sp u citoplazmi limfocita, monocita ili neutrofila u krvi.

Mikologija

Histoplazma capsulatum je patogena gljivica koja se često dijagnosticira mikroskopskim promatranjem različitih uzoraka tkiva obojenih Wrightovom mrlje.

Kako se opažaju strukture uzorka krvi s Wrightovom mrljom?

Izvor: Retamales E, Mazo V. Institut za javno zdravstvo, Vlada Čilea. Preporuke za mrlje na krvnim mrljama za čitanje hemograma.

Preporuke za dobro bojenje

Stabilni uzorci krvi trebaju se spontano osušiti. Razmazi trebaju biti što tanji kako bi se postigla bolja fiksacija boje i izbjegla prekomjerna mrlja.

Za visokokvalitetno bojenje preporučljivo je obojati u roku od dva sata od pripreme razmaza. S druge strane, idealan uzorak je kapilarna krv, bez antikoagulansa.

Međutim, ako se koristi venska krv, treba je koristiti kao antikoagulans EDTA, a ne heparin, jer potonji može deformirati stanične strukture.

Da bi se izbjeglo propadanje pripremljenog bojila, treba ga čuvati na suhom mjestu.

Tijekom postupka pranja preporuča se uporaba vode prilagođene neutralnom pH.

Na kraju, preporučljivo je povremeno testirati metode bojenja koje se koriste u laboratoriju.

To se postiže bojenjem uzoraka ili proširenim uzorcima, kao kontrola kvalitete. Ovaj korak je važan, jer osigurava da se bojenje pravilno pripremi i vremena bojenja dobro standardiziraju.

Ako je list uzorka slabo obojen, tada postoje problemi koji se moraju riješiti.

Česte pogreške u Wright obojenju

Vrlo blijeda mrlja

Vrlo blijede mrlje nastaju obično zbog vrlo kratkog vremena bojenja ili pretjeranog pranja. Ispravlja se produženjem vremena kontakta s bojom ili smanjenjem vremena pranja.

Talog boje

Prisutnost taloga boje u razmazu može imati nekoliko uzroka, međutim, najčešći uzroci su: upotreba nefiltriranog bojila, bojenje na neravnim mostovima mrlja, korištenje listova prljavih prašinom ili mastima, a ne ispiranje dobro potpuno obojenje.

Izuzetno crveni ili plavi razmaz

Pufer je odgovoran za pH boje. Boje s pH ispod navedenog (kisele) rezultirat će vrlo crvenkastim mrljama.

Ako je pH bojila iznad (alkalnog), dobit će se izuzetno plavkast razmaz.

Način pohrane

Reagens treba čuvati na sobnoj temperaturi.

Reference

1. Gutiérrez V. Usporedna studija između Wright metode bojenja i Elisa testa za dijagnozu pasje ehrlichiosis u gradu San Pedro Sula, Honduras. 2008. diplomski rad da bi se kvalificirao za veterinarski medicinski fakultet. Sveučilište San Carlos u Gvatemali.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Osnovne mrlje u mikrobiološkom laboratoriju. Istraživanje invalidnosti. 2014; 3 (1): 10-18.
3. "Wright je mrlja." Wikipedia, Slobodna enciklopedija. 18. svibnja 2018., 12.05 UTC. 8 prosinac 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Učestalost bakterije Babesia spp. u lovu na konje, Córdoba (Kolumbija). Vlč. Udcaactual divulg cient. 2013 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Bailey & Scott mikrobiološka dijagnoza. 12 ed. Argentina. Uredništvo Panamericana SA
6. Retamales E, Mazo V. Institut za javno zdravstvo Čilea. Preporuke za mrlje na krvnim mrljama za čitanje hemograma.