MRLJE OD GRAMA: OBRAZLOŽENJE, MATERIJALI, TEHNIKA I UPOTREBA - BIOLOGIJA - 2026

Bojenje po Gramu je najjednostavniji i najkorisniji bojenje tehnika u dijagnostičkoj mikrobiologije. Ovu je tehniku ​​stvorio danski liječnik Hans Christian Gram 1884., koji je uspio klasificirati bakterije kao Gram pozitivne i Gram negativne, prema sastavu stanične stijenke.

Tehnika je pretrpjela određene izmjene Huckera 1921. radi stabiliziranja reagensa i poboljšanja kvalitete bojenja, zbog čega je mrlja po Gramu poznata i kao Gram-Hucker.

Različiti razmazi mrlje po Gramu. A. Gram pozitivne koke. B. Gram negativne šipke. C. Gram-pozitivne, polimorfonske i mononuklearne šipke. D. Kvasci.

Ovom tehnikom moguće je i promatrati oblik mikroorganizama, odnosno ako su to među ostalim kokci, bacili, kokobacili, pleomorfni, nitasti. Kao i njegova raspodjela u prostoru: u grozdu, u lancu, izolirani, u parovima, u tetradama itd.

Kada se sumnja na bakterijsku infekciju, većinu primljenih uzoraka treba razmazati na toboganu i obojati Gramom za mikroskopsko ispitivanje.

Gramovo izvješće uputit će liječnika o tome kakav tip mikroorganizma može biti uzrok infekcije, prije nego što dobije konačni rezultat kulture.

U nekim je slučajevima život pacijenta vrlo ugrožen, pa liječnicima hitno treba Gram-ovo izvješće kako bi se postavilo empirijsko liječenje, dok čekaju na identifikaciju mikroorganizma.

Primjerice, ako Gram otkriva da u cerebrospinalnoj tekućini ima gram gramzivih koka, liječnik će uputiti početnu terapiju antibioticima koji eliminiraju ovu vrstu bakterija, u skladu s protokolima utvrđenim za to.

Jednom kada dođe do konačnog rezultata s nazivom izoliranog mikroorganizma i odgovarajućeg antibiograma, liječnik će procijeniti treba li ili ne promijeniti terapiju. Ta će se odluka donijeti prema studiji osjetljivosti mikroorganizma na antibiotike koje prima i evolucije pacijenta.

osnova

Ovo je tehnika koja ima 4 temeljna koraka: bojenje, fiksacija metlom, uklanjanje boje i kontrasta. Stoga ova tehnika osim bojanja bakterijama omogućuje i njihovo razlikovanje.

Kristalna ljubičica je prvo upotrijebljeno bojilo. Ima afinitet prema peptidoglikanu i obojat će sve prisutne bakterije ljubičaste boje, nakon toga se stavlja lugol, koji djeluje kao mordant, odnosno inducira stvaranje nerastvorljivih kristalno-ljubičasto-jodnih kompleksa - ribonuklearnih proteina unutar stanice.,

Gram pozitivne bakterije, koje imaju debelu stijenku peptidoglikana, tvore više kompleksa (kristalno ljubičasti jod), pa zadržavaju boju.

Osim toga, također utječe na to da u stilu Gram pozitivnih bakterija sadrži veću količinu nezasićenih kiselina, koje pokazuju veliki afinitet prema oksidansima (Lugol).

U međuvremenu, gram-negativne bakterije imaju tanki sloj peptidoglikana, zbog čega bakterije formiraju manje komplekse od gram-pozitivnih.

Tada dolazi korak uklanjanja boje, gdje se gram-gram i gram negativne bakterije ponašaju različito.

Gram negativne bakterije sadrže vanjsku membranu bogatu lipopolisaharidima koja je dio njihove stanične stijenke. Masti se uništavaju kontaktom s acetonskim alkoholom, tako da se vanjska membrana destabilizira, oslobađajući ljubičasti kristal.

Ovako se suprotstavlja safraninu ili osnovnom fuksini koja postaje crvena.

U slučaju Gram pozitivnih bakterija, otporne su na izblijedjivanje jer izbjeljivač djeluje zatvarajući pore, sprečavajući kristalno ljubičasti / jodni kompleks da iscuri van.

Stoga, boja s kristalnom ljubičicom ostaje stabilna i nema mjesta za safranin ili fuksin. Zbog toga ove bakterije mrlje duboko plavu ili ljubičastu boju.

materijali

Gramov set za bojenje sastoji se od:

• Ljubičasta stakla
• Lugol
• Aceton alkohol
• Safranin ili osnovni fuksin

Priprema boja i reagensa

Kristalna ljubičasta otopina

Rješenje za:

Ljubičasti kristal ------------- 2 gr

Etilni alkohol 95% ----------- 20cc

Rješenje B:

Amonijev oksalat ----------- 0,8 gr

Destilirana voda ------------- 80 ccm

Za konačnu pripremu kristalne ljubičice, otopina A mora se razrijediti 1:10 s destiliranom vodom i pomiješati s 4 dijela otopine B. Smjesa se čuva 24 sata prije upotrebe. Filtrirajte u bocu s jantarnim bojama pomoću papirnog filtra.

Količina koja se dnevno koristi prebacuje se u bocu s kapljicama ćilibara.

Jod-Lugol

Ocijenite i izmjerite naznačenu količinu svakog spoja, kako slijedi:

Jodni kristali ------------- 1gr

Kalijev jodid ------------- 2gr

Destilirana voda ------------- 300 ccm

Kalijev jodid rastvara se malo po malo u vodi, a zatim se dodaje jod. Otopina je obrijana u ambre bocu.

Količina koja se svakodnevno koristi prenosi se kapaljkom u manju bocu jantara.

izbjeljivanje

95% etilnog alkohola -----------– 50 ml

Aceton ------------------ 50 ml

Priprema se u jednakim dijelovima. Pokrijte dobro, jer obično ispari.

Stavite u bočicu s kapaljkom.

Ovaj pripravak omogućuje promjenu boje u umjerenom vremenu 5-10 sekundi i najviše se preporučuje.

Početnici radije koriste samo 95% etilnog alkohola, gdje je blijeđenje sporije od 10 do 30 sek.

Dok iskusniji mogu koristiti čisti aceton gdje se obezbojenje događa vrlo brzo od 1 do 5 sek.

Kontrast

Safraninovo rješenje dionica

Safranina -------------– 2,5 gr

Etilni alkohol 95% --------– 100 ccm

Nakon vaganja navedene količine safranina, on se otopi u 100 ml 95% etilnog alkohola.

Radna otopina safranina priprema se iz matične otopine.

Da biste to učinili, izmjerite 10 cc temeljne otopine, dodajte 90 cc destilirane vode i napravite 100 ml.

Preporučuje se prenijeti količinu koja se koristi dnevno u ambre bocu s kapalicom.

Mikroorganizmi koji slabo mrlje po Gramu-Huckerovoj mrlji, poput određenih anaeroba, Legionella sp, Campylobacter sp i Brucella sp, mogu se obojati mnogo bolje koristeći Kopeloffovu modifikaciju Gram-Hucker mrlje, naziva se Gram-Kopeloff mrlja.

Ovom tehnikom boja safranina mijenja se u osnovni fuksin. Pomoću ove modifikacije moguće je učinkovito obojati spomenute mikroorganizme.

Skladištenje reagensa

Pripremljena bojila trebaju se čuvati na sobnoj temperaturi.

Priprema razmaza uzorka koji će se obojati

Uzorak mora sadržavati najmanje 10 ⁵ mikroorganizama prije promatranja mikroorganizma u testu je vjerojatno. Razmazi se mogu načiniti izravnim uzorkom ili iz kultura u čvrstom ili tekućem mediju.

Razmazi trebaju biti jednoliki, dobro raspoređeni i ne pregusti za bolju vizualizaciju prisutnih struktura.

-Grame izravnih uzoraka

Gram necentrificiranog urina

Urin je pomiješan i 10 ml stavljeno na klizač. Promatranje barem jedne bakterije / uljnog polja ukazuje da postoji infekcija.

To znači da će kultura imati oko više od 100 000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / mL) urina u 85% slučajeva.

Ova metoda nije korisna za broj kolonija ispod 100 000 CFU.

CSF Gram

CSF treba centrifugirati, supernatant ukloniti, a pelet širiti na klizaču. Ova tekućina je sterilna u normalnim uvjetima; promatranje bakterija ukazuje na infekciju.

Gram respiratornih uzoraka

Ispiranje ispljuvaka, bronhija ili bronhoalveolara Gram, iako može postojati niz mikroorganizama, uvijek će voditi dijagnozu, osim što će biti korisna vrsta promatranih stanica.

U slučaju ispljuvka, potrebno je pripremiti razmaz s najviše gnojnim dijelovima uzorka.

Gram stolice

Ne preporučuje se izvođenje Grama na ovoj vrsti uzoraka, jer nema dijagnostičku vrijednost.

-Grame usjeva

Mogu se izvesti na dva načina, jedan iz tekućih kultura, a drugi iz čvrstih kultura.

Tekuće kulture

Iz tekućih kultura je krajnje jednostavno; Nekoliko pečenja zamućenog juha uzima se ispod plamenika i stavlja se na čist i suh tobogan, praveći kružne pokrete od središta prema periferiji, kako bi se materijal ravnomjerno rasporedio.

Ostavite da se spontano osuši na zraku. Jednom kada se osuši, materijal se pričvršćuje na lim toplinom. Da biste to učinili, uz pomoć pincete, list se propušta 3 do 4 puta kroz plamen Bunsenovog plamenika, pazeći da materijal ne izgori.

Pusti se da se list ohladi i postavi se na most za bojanje.

Čvrsti usjevi

Da bi se izvršio bris mrlje po Gramu iz čvrste kulture, postupite na sljedeći način:

Prije nego što odaberete kolonije koje će se uzeti, potrebno je pripremiti slajd u koji se stave otprilike dvije kapi sterilne fiziološke fiziološke otopine.

Ako originalna ploča s kulturom sadrži nekoliko različitih vrsta kolonija, za svaki Gram bit će odabrana izolirana kolonija. Svaka će se kolonija uzeti platinastom petljom kako bi se otopila u fiziološkoj otopini koja je prethodno stavljena na slajd.

Kružni pokreti napravljeni su od središta prema periferiji, kako bi se homogeno raspodijelila kolonija na klizaču.

Ostavite da se spontano osuši na zraku. Jednom kada se osuši, list se učvršćuje toplinom, kao što je ranije objašnjeno (plamenom klizača upaljačem), pazeći da materijal ne izgori.

Ovaj se postupak mora izvesti s različitim kolonijama. Na komadu papira treba zabilježiti redoslijed onoga što se opaža, na primjer:

Kolonija 1: Beta-hemolitička žuta kolonija: U grozdovima su opaženi gram-pozitivni koci

Kolonija 2: Kreme obojena kolonija, bez hemolize: Primjećeni su gram negativni kokobacili.

Svaki slajd mora biti označen kako bismo znali što promatramo.

Tehnika

Tehnika bojenja po Gramu vrlo je jednostavna za izvedbu i relativno jeftina te se ne može propustiti u mikrobiološkom laboratoriju.

Izvodi se na sljedeći način:

1. Fiksirajte razmaz toplinom i stavite na most za bojenje.
2. Klizač prekrijte potpuno kristalnom ljubičicom 1 minutu.
3. Isperite vodom Ne osušite
4. Prekrijte list otopinom lugola, ostavite da djeluje 1 minutu. Isperite vodom Ne osušite.
5. Izbelite 5-10 sekundi uz lagano miješanje u alkoholnom acetonu. Ili postavite plahtu u vertikalni položaj i na površinu kapljite kapljice sredstva za uklanjanje boje, sve dok se ne ukloni višak neispunjenog ljubičastog stakla. Ne prekoračite.
6. Isperite vodom Ne osušite.
7. Zamijenite klizač na mostu za bojenje i pokrijte 30 sekundi safraninom (Gram-Hucker) ili 1 min osnovnim fuksinom (Gram-Kopeloff).
8. Operite vodom
9. Ostavite da se spontano osuši u uspravnom položaju.

Jednom kada se osuši, u svjetlosni mikroskop stavite 1 kap potopnog ulja da biste je promatrali ispod cilja 100X.

Korisnost

Ova tehnika omogućuje razlikovanje morfotintorijalnih razlika većine bakterija.

Kvasci se također razlikuju po ovoj boji. Uzmu kristalno ljubičastu, odnosno mrlju po Gramu.

S druge strane, mogu se razlikovati Gram-pozitivne bacile koji stvaraju spore, u kojima se promatra jasan prostor unutar bacila, gdje se formirao endospor, iako spore ne mrlje dobro. Ostale tehnike poput Shaeffer-Fultona koriste se za bojenje spora.

Treba napomenuti da se ovo bojenje ne koristi za bojanje svih vrsta bakterija, to jest, postoje slučajevi u kojima bojanje ne djeluje.

U ovom slučaju mogu se spomenuti bakterije kojima nedostaje stanična stijenka. Na primjer: rod Mycoplasma, sferoplasti, ureaplasma, L-oblici i protoplasti.

Također mrlje bakterije sa zidovima bogatim mikoličnim kiselinama, poput mikobakterija, i unutarćelijskim bakterijama, kao što su klamidija i riketija.

Također je neučinkovit u bojenju većine spirohetalnih bakterija.

Postoje bakterije istog roda koje se mogu promatrati na istom uzorku kao i gram-gram i gram negativan. Kada se to dogodi naziva se varijabilnom Gram mrljom, koja može biti posljedica promjene hranjivih tvari, temperature, pH ili koncentracije elektrolita.

Uobičajene pogreške

Pretjerano izbjeljivanje

Pretjerivanje u koraku promjene boje može dovesti do promatranja lažnih Gram negativnih mikroorganizama.

Ne čekajući dovoljno dugo vrijeme sušenja da biste dodali uranjanje ulje

Može prouzrokovati da Gram pozitivne bakterije oboje Gram negativno (lažno Gram negativno). To se događa jer u starim kulturama vjerojatno ima mrtvih ili pokvarenih bakterija i pod tim uvjetima bakterije ne zadržavaju kristalno ljubičastu.

Koristite vrlo staru otopinu lugola:

S vremenom lugol gubi svojstva i boja mu blijedi. Ako se koristi već degenerirani reagens, on neće dobro učvrstiti kristalno ljubičastu, pa postoji mogućnost dobivanja vizualizacije lažno gram negativnih mikroorganizama.

Plava pozadina

Ispravno obezbojena pozadina će biti crvena. Plava pozadina ukazuje na to da je obezbojenje bilo nedovoljno.

Reference

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Medicinska mikrobiologija, 6. izdanje McGraw-Hill, New York, SAD
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. (5. izd.). Argentina, uredništvo Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiološka dijagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Uredništvo Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Opća mikologija. Drugo izdanje Središnjeg sveučilišta u Venezueli, izdanja biblioteka. Venezuela Caracas.
5. "Gram mrlja." Wikipedia, Slobodna enciklopedija. 4. listopada 2018, 23:40 UTC. 9 pro 2018, 17:11. Preuzeto s es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Priručnik medicinske mikrobiologije. Drugo izdanje, Venezuela: Direkcija za medije i publikacije Sveučilišta u Carabobou.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Osnovne mrlje u mikrobiološkom laboratoriju. Istraživanje invalidnosti. 2014; 3 (1): 10-18.