KATALAZNI TEST: OBRAZLOŽENJE, TEHNIKA I UPOTREBE - BIOLOGIJA - 2025

Katalaze Test je metodologija korištena u Bakteriologija laboratorija da bi se otkrilo prisustvo enzima katalaze u tim bakterijama koje ga posjeduju. Zajedno s mrljom po Gramu, oni su glavni testovi koje je potrebno izvesti na novo izoliranim mikroorganizmima. Ovi testovi usmjeravaju mikrobiologa na korake koje treba poduzeti za konačnu identifikaciju predmetnog mikroorganizma.

Općenito, bakterije koje sadrže citokrom posjeduju enzim katalazu, što znači da bi je trebalo posjedovati fakultativne aerobne i anaerobne bakterije. Međutim, postoje iznimke, poput Streptococcus-a, koji iako su fakultativni anaerobni mikroorganizmi, ne posjeduju enzim katalazu.

Pokretanje katalaznog testa, pokazujući pozitivnu reakciju. Izvor: Nije naveden autor čitljiv autor. Nase pretpostavljen (na temelju tvrdnji o autorskim pravima).

Zbog toga se katalazni test prvenstveno koristi za razlikovanje obitelji Staphylococaceae i Micrococaceae (obje katalazne pozitivne) od porodice Streptococaceae (negativne katalaze).

Isto tako, rod Bacillus (katalazno pozitivan) razlikuje se od roda Clostridium (negativan katalaz).

osnova

Katalaza je enzim klasificiran kao hidroperoksidaza, to znači da kao supstrat koriste vodikov peroksid (H ₂ O ₂).

Također se smatra oksidoreduktazom, jer u reakciji u kojoj sudjeluje postoji element koji služi kao davatelj elektrona (reducirajuća tvar), a drugi kao receptor elektrona (oksidirajuća tvar).

Katalaza je protein koji sadrži prozorsku skupinu s četiri trovalentna atoma željeza (Fe ⁺⁺⁺), stoga je homoprotein. Ferni ion ostaje oksidiran tijekom reakcije.

Može se reći da je katalaza detoksificirajući enzim, jer je njezina funkcija uklanjanje tvari koje nastaju tijekom metabolizma bakterija koji su toksični za bakterije. Među tim tvarima je vodikov peroksid.

Vodikov peroksid nastaje aerobnim raspadom šećera. Taj se proces odvija na sljedeći način:

Superoksid ion (O ₂ ^-) (slobodni radikal) oblikovan kao krajnjeg proizvoda asimilacije glukoze u aerobnoj putem. To je toksično i eliminira ga enzim superoksid dismutaza koji ga pretvara u plinoviti kisik i vodikov peroksid.

Vodikov peroksid također je toksičan za bakterije i mora se ukloniti. Enzim katalaz razgrađuje vodikov peroksid u vodu i kisik.

Katalaza može djelovati na supstrate osim vodikovog peroksida, poput alkohola, aldehida, kiselina, aromatskih amina i fenola. Međutim, vodikov peroksid se također može koristiti katalazom za oksidaciju drugih toksičnih spojeva poput metilnog i etilnog alkohola.

Isto tako, katalaza je prisutna u fagocitnim stanicama, štiteći je od toksičnog djelovanja vodikovog peroksida.

Rutinska tehnika za katalazni test

-Klizna metoda

materijali

3% vodikovog peroksida (10 svezaka).

Klizač mikroskopa

Jednokratna plastična ručka ili drveni čačkalica.

Postupak

Uzmi dovoljno kolonije za proučavanje, a da ne dotakne agar iz kojeg je došao. Kolonija mora biti svježa, to jest iz kulture od 18 do 24 sata.

Mjesto kolonije na suhu ploču i dodati kap 3% -tnim vodikovim peroksidom na njega (30% H ₂ O ₂ se također može koristiti). Odmah primijetite da li se puštaju mjehurići ili ne.

Tumačenje

Pozitivna reakcija: evolucija plina, o čemu svjedoči stvaranje mjehurića (snažno bubanje).

Negativna reakcija: nema stvaranja mjehurića.

-Direktna metoda u čistoj kulturi

Mjesto 1 ml 3% H ₂ O ₂ na čistu pločicu ili klin kulture koji ne sadrži krv (poželjno hranjivi agar). Promatrajte postoji li ili nema formiranja mjehurića odmah. 30% H ₂ O ₂ se također može koristiti.

Interpretira se isto kao i metoda objekta porta.

-Metoda s kapilarnom cijevi ili Fung i Petrishko

Kapilarnu cijev od 67 mm do visine od 20 mm napunite s 3% vodikovim peroksidom.

Dodir izolirana kolonija koji se proučava u kapilare napuni s 3% H ₂ O ₂ . Promatrajte je li se kapilara napunila mjehurićima za otprilike 10 sekundi. Ova metoda omogućava polukvantificiranje reakcije u križima:

Bez križeva nema mjehurića (negativna reakcija).

+ ---- Malo mjehurića (slaba ili odgođena reakcija).

++ --– Obilni mjehurići (umjerena reakcija).

+++ - Mjehurići dosežu suprotni kraj (jaka reakcija).

-Taylor i Achanzar metoda za katalazne testove koji dovode u pitanje

Stavite izoliranu koloniju na čist, suh tobogan, a zatim stavite kap od 0,5% H ₂ O ₂ i prekrijte pokrivačem. Promatrajte postoji li ili ne nastaje zarobljeni mjehurići.

Tumačenje: prisutnost mjehurića ukazuje na pozitivnu reakciju. Nema mjehurića, to se tumači kao negativna reakcija.

Katalazni test za vrste Mycobacterium

Ovu tehniku ​​treba obaviti kontrolom pH i temperature. Mora se izvesti pod poklopcem laminarnog toka jer je manipuliranje različitim vrstama Mycobacterium opasno.

-Materials

Vodikov peroksid 30% ili 110 volumena (superoksal).

Fosfatni pufer pH 7

10% između 80

Klinička kultura mikobakterija 3 do 4 tjedna

-Preparation

Fosfatni pufer pH 7

Težiti:

1.361 g bezvodnog monokalijevog fosfata (KH ₂ PO ₄).

1.420 g bezvodnog dinatrijevog (Na2HPO3) fosfata.

Otopite obje soli u malo sterilne destilirane vode i dopunite do 1000 ml vode.

10% između 80

Napravite otopinu od 1:10 u komercijalno koncentriranom Tween 80 kako biste postupili na sljedeći način:

Uzmite 1 ml Tween 80 i stavite ga u malo destilirane vode, otopite i zatim dopunite volumen s vodom do 10 ml.

Konačni reagens

Pomiješajte količinu fosfatnog pufera s količinom od 10% Tween 80 (jednaki dijelovi). U laboratoriju odredite koliko želite pripremiti.

-Postupak

Stavite 5 ml fosfatnog pufera u sterilnu epruvetu s navojem (bakelit).

Uz inokulacijskom petljom uzmite dovoljno kolonija Mycobacterium izraslih u klinovima i otopite u fosfatnom puferu.

Zatvorite cijev bez previše zatezanja navoja. Stavite u vodenu kupelj na 68 ° C 20 do 30 minuta. Izvadite i ostavite da se ohladi na 22-25 ° C

Izmjerite 0,5 ml završnog reagensa (smjese) i dodajte ga u epruvetu s hladnom otopinom. Promatrajte formiranje ili ne mjehuriće.

Tumači se isto kao i prethodne tehnike.

Koristiti

Kada se dobije rast kolonije u obogaćenom mediju, na dobivenim kolonijama treba obaviti mrlju po Gramu i test katalaze. To će mikrobiologa uputiti u postupke koje treba poduzeti za definitivno utvrđivanje.

Izvor: Pripremio autor mag. Marielsa gil

QA

Za ocjenu dobre izvedbe reagensa vodikovog peroksida koristite svježe uzgajane kontrolne sojeve, poput Staphylococcus aureus kao pozitivnu kontrolu i sojeve Streptococcus sp kao negativnu kontrolu.

Druga alternativa koja služi kao pozitivna kontrola je stavljanje kapi vodikovog peroksida na agar u krvi, eritrociti imaju katalazu, stoga će doći do bubrenja ako je reagens u dobrom stanju.

Čokoladni agar može se koristiti kao negativna kontrola, eritrociti su već lizirani i test je negativan.

Ograničenja

-Ne koristite stare kulture za test, jer to može uzrokovati lažne negativnosti.

- izbjegavajte uzimanje kolonija iz kultura na krvnom agaru, ako pazite da ne dodirnete agar; Ovaj postupak može dovesti do lažnih pozitivnih rezultata, jer crvena krvna zrnca sadrže katalazu.

-Ako uzmete koloniju platinastom ručkom, nemojte preokrenuti redoslijed postupka jer to može stvoriti lažne pozitivne rezultate. To je zbog toga što je platina sposobna reagirati s vodikovim peroksidom, uzrokujući bubrenje.

-Ne upotrebljavajte reagens vodik-peroksida ako je vrlo star, jer je reagens vrlo nestabilan i ima tendenciju raspada.

- reagens vodik peroksida čuvajte od svjetlosti i rashladite ga kako biste spriječili oštećenje.

- Obavljajte kontrolu kvalitete reagensa vodikovog peroksida svaki put kada se koristi.

-Uzmi u obzir da ako 30% H ₂ O ₂ koristi, reakcije su jači nego provodi s 3% H ₂ O ₂.

Reference

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiološka dijagnoza. 12 ed. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Biokemijski testovi za identifikaciju bakterija kliničkog značaja. 3. izd. Uredništvo Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. BD Laboratoriji. Katalazno-gotarski reagens. Dostupno na:
5. Vadequímica Laboratories. Peroksid. Ekvivalencija između volumena i postotka. Dostupno na: vadequimica.com