PROTEINAZA K: KARAKTERISTIKE, ENZIMSKA AKTIVNOST, PRIMJENE - BIOLOGIJA - 2025

K proteinaza je enzim koji spada u skupinu serinskih proteaza, tj, ona je u sredini ima katalitički aktivni serin aminokiselina i ima funkciju razbijanje peptidne veze hidrolizom. Zauzvrat, ovaj enzim pripada obitelji proteina subtilisina (peptidaza S8).

Proteinaza K ima molekulsku masu (MW) od 28.900 daltona, a prvi put je izolirana 1974. u ekstraktima gljivice album Engyodontium, ranije poznata kao Tritirachium album Limber.

Molekularna struktura proteinaze K. Izvor: Lykchiniadis

Ima visoku proteolitičku sposobnost, što je dokazano sposobnošću razgradnje keratina koji je prisutan u kosi. Riječ keratin na engleskom jeziku piše "keratin", otuda je nazvana i "proteinaza K".

Zbog svoje velike snage za cijepanje nativnih proteina, ovaj enzim je koristan u različitim tehnikama molekularne biologije. Primarno se koristi za izoliranje i pripremu nukleinskih kiselina visoke molekulske mase (MW).

Proteinaza K djeluje tako što oslobađa nuklearnu DNK, istovremeno uništavajući proteine ​​i inaktivira RNaze i DNaze, odnosno eliminira nukleaze u preparatima DNA i RNA.

S druge strane, vidljivo je da proteinaza K može hidrolizirati neke denaturirane nativne proteine, što je pobudilo interes istraživača za njezinu upotrebu u proučavanju prionskih proteina (PrPC).

Međutim, unatoč visokoj proteolitičkoj potenciji, postoje proteini otporni na djelovanje proteinaze K. Među njima su i neki nenormalni proteini koji se nazivaju prioni (PrPSc), povezani s prijenosnim spongiformnim encefalopatijama.

Karakteristike proteinaze K

Proteinaza K ima tercijarnu strukturu sastavljenu od tri sloja, sa 7-lančanim P-pločom, smještenim između dva sloja vijaka. Kako spada u skupinu peptidaza S8, karakterizira ga katalitička trijada na aktivnom mjestu, čiji je redoslijed redoslijeda (Asp, His i Ser), koji ih razlikuje od ostalih obitelji peptidaza.

Ovaj enzim iz skupine serinskih proteaza karakterizira hidroliziranjem peptidnih veza bliskih karboksilnoj skupini alifatskih i aromatskih aminokiselina.

S druge strane, sposobna je djelovati u prisutnosti određenih korozivnih tvari, poput natrijevog dodecil sulfata (SDS), Tris-HCL i EDTA, koji se koriste za pomoć u denaturaciji proteina, uslijed čega gube nativnu strukturu.

Ovo je preliminarni korak u pripremi proteina za tehniku ​​elektroforeze. Raspon pH na koji djeluje proteinaza K prilično je širok (2,0 do 12,0), s optimalnim pH između 7,5 i 12,0, a njegova izoelektrična točka je 8,9. Kao što se može vidjeti, aktivan je protiv vrlo širokog raspona pH.

Druga karakteristika koja se ističe u proteinazi K je njegova stabilnost u prisustvu visokih temperatura (50 - 60 ° C).

Enzimska aktivnost

Proteinaza K zahtijeva prisustvo kalcijevog iona, iako to ne utječe na njegovu aktivnost, ako je nužno za održavanje njegove stabilnosti.

Da bi proteinaza K u potpunosti probavila supstrat, potrebno je vrijeme kontakta od otprilike 5 minuta do 2 sata.

Međutim, u tom smislu, Daza i suradnici usporedili su čistoću DNK dobivenu u različitim vremenima izlaganja proteinazi K, te zaključili da produljena inkubacija (do 24 h) značajno poboljšava kvalitetu DNK.

Međutim, u odnosu na koncentraciju enzima proteina K K koja se koristi u različitim protokolima, može se reći da je on vrlo raznolik.

Može se koristiti od vrlo niskih koncentracija (5 µg / ml) do koncentracija od 500 µg / ml. No, najčešće radne koncentracije kreću se u rasponu od 50-100 µg / ml, posebno za varenje proteina i inaktivaciju nukleusa. Iako je za liječenje tkiva potrebna koncentracija od 2 mg / ml.

Prijave

Primjene su mu vrlo široke i mogu se sažeti na sljedeći način:

-Koristi se u probavi proteina i ekstrakciji DNA različitim postupcima kao što su: soljenje, PK-SDS, cetil-trimetil amonijev bromid (CTAB), modificirani kalijev acetat i ekstrakcija natrijevim jodidom.

-Inativacija nukleusa (RNaze i DNaze).

-U tehnici in situ hibridizacije (HIS), radi oslobađanja nukleinske kiseline, pored uklanjanja nepoželjnih proteina.

-Modifikacija proteina.

-Na razini istraživanja, u raznim studijama.

Prednosti proteinaze K

Provedeno je nekoliko komparativnih studija između tehnika ekstrakcije DNK koje koriste proteinazu K, s drugima koje ga ne koriste, a sve zaključuju da su veće koristi od upotrebe enzima. Prednosti uključuju sljedeće:

Dobiva se DNA visoke molekularne težine, visoke kvalitete i čistoće.

- Izvađena DNK stabilna je do 3 mjeseca.

Izvađena DNA može se koristiti u sljedećim tehnikama: Southern blot, lančana reakcija polimeraze (PCR), elektroforeza, između ostalih.

Proteini otporni na K

Različita istraživanja su zaključila da se prioni (nenormalno toksični PrPSc proteini) razlikuju od PrPC (nativnih) proteina po tome što su otporni na djelovanje proteinaze K, dok su PrPC osjetljivi na njegovo djelovanje.

Drugi su autori opisali da u strukturi PrPSc postoje osjetljivi dijelovi i drugi otporni na proteinazu K. Međutim, oba su dijela podjednako toksična i zarazna.

S druge strane, Bastian i dr. 1987. izolirali su 4 proteina od 28, 30, 66 i 76 kda od vrste Spiroplasma mirum. Za sve je nađeno da su otporni na djelovanje proteinaze K, a također su imali i unakrsnu reakciju s nekim prionima.

Poznato je da ova vrsta može uzrokovati kataraktu i značajna neurološka oštećenja, a zbog Bastianovih znanstvenih otkrića, među ostalim istraživanjima, pokušao se povezati ovaj mikroorganizam s prijenosnim spongiformnim encefalopatijama.

Međutim, etiologija ove degenerativne neurološke patologije i danas se pripisuje prionima.

U tom smislu, Butler i dr. 1991. identificirali su i okarakterizirali klasu proteina otpornih na proteinazu K od 40 kda iz dva soja Mycoplasma hyorhinis. Ovaj patogen utječe na svinje, inficirajući njihova tkiva, ali u ovom slučaju nije bilo unakrsne reakcije s testiranim prionima.

Potrebno je još istraživanja kako bi se rasvijetlile mnoge nepoznanice u tom pogledu.

Reference

1. Bastian F, Jennings R i Gardner W. 1987. Antiserum na fibrilski protein povezan s strugarom reagira s proteinom Spiroplasma miru m fibril. J. Clin. Microhiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Procjena metode ekstrakcije i pročišćavanja DNA iz mišićnog tkiva fiksiranog formaldehidom neidentificiranog trupa. Med Magazin, 2014.; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E i Mcgarrity G. Identifikacija i karakteristike proteinaza otpornih na K u proteinima pripadnika klase Mollicutes. Infekcija i imunitet, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Usporedba dva protokola ekstrakcije DNA Trypanosoma cruzi uzgajana u aksenskom mediju. Vlč. Peru. Med. Exp. Public Health 2014; 31 (2): 222-227. Dostupno na: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E i Palma W. Određivanje učinkovitosti pet protokola ekstrakcije DNA iz parafiniranog materijala za molekularne studije. Vlč. Méd Univ Kostarika. 2007; 1 (1): 10-19.