STANDARDNA AGAR KUGLICA: OBRADA, PRIPREMA I UPOTREBE - BIOLOGIJA - 2026

Standardni broj agara je solidan, neselektivni medij za kulturu, dizajniran za kvantifikaciju aerobnog mikroorganizama prisutnih u uzorcima pitke vode, otpadne vode, mliječnih napitaka, među ostalim namirnicama. Ovaj medij je također poznat i kao PCA agar, zbog njegove kratice na engleskom Plate Count Agar. Stvorili su ga 1953. godine Buchbinder, Baris i Goldstein.

Standardni agarni medij za brojanje sastoji se od ekstrakta kvasca, tripteina, glukoze, agara i destilirane vode. Ova formulacija sadrži osnovne prehrambene elemente koji omogućuju razvoj postojećeg aerobnog opterećenja mikroba, a ne zahtjevnog.

Decimalna razrjeđenja za brojanje CFU-a u standardnom brojaču agara. Izvor: Quentin Geissmann

Kako medij ne sadrži inhibitore, bakterije mogu rasti bez ikakvih ograničenja, što ga čini idealnim za opće brojanje kolonija. Međutim, tehnika kvantifikacije plaka neće otkriti sve prisutne bakterije, već samo one koje su sposobne za rast u okolišnim uvjetima kojima je podvrgnut zasijani standardni agar za brojanje.

U tom smislu, tehnikom kvantifikacije ploča obično se želi utvrditi količina bakterija aerobnog mezofilnog tipa, odnosno onih koje se razvijaju na temperaturama između 25 i 40 ° C, s optimalnom temperaturom rasta od 37 ° C., Ova bakterijska skupina je vrlo važna, jer se većina patogenih bakterija za čovjeka nalazi tamo.

Treba napomenuti da ponekad može biti zanimljivo kvantificirati količinu psihrofičnih bakterija prisutnih u hrani. Ove bakterije su one koje rastu na niskim temperaturama (<20 ° C) i odgovorne su za što se hrana razlaže brže, čak i kad se ohladi.

Isto tako, termofilne bakterije, koje se razvijaju u području između 50 ° C i 80 ° C ili više, mogu biti važne u određenim vrstama hrane, poput konzervirane hrane.

Kvantifikacija mikrobima izražava se u jedinicama koje formiraju koloniju (CFU) po gramu ili mililitru uzorka.

osnova

Standardni medij za brojanje osmišljen je kako bi omogućio uspješan rast nehrabrivih aerobnih bakterija kao ekstrakt kvasca, tritein i glukoza koji osiguravaju potrebne hranjive tvari za dobar rast mikroba.

S druge strane, podloga ima svijetlu boju i proziran izgled, zbog čega je idealan za vizualizaciju kolonija razvijenih metodom dubokog sjetve (izlijevanje u tanjur).

Moguće je i brojanje kolonija metodom površinske setve površine lopatice Drigalski.

Kad je opterećenje mikrobima veliko, potrebno je izvršiti decimalna razrjeđenja uzorka ispitivanja kako bi se mogao brojiti CFU.

Treba napomenuti da ovaj medij preporučuje Američko udruženje za javno zdravstvo (APHA) za broj aerobnih mezofila.

priprema

Odvažite 23,5 g dehidriranog medija i otopite u litri destilirane vode. Da bi se potpuno otopila, smjesu treba grijati uz često miješanje dok ne proključa. Naknadni koraci ovise o tehnici setve koja se koristi.

Za tehniku ​​lijevanja ploča

Raspodijelite doziranjem 12 do 15 ml u epruvete. Nakon toga, sterilizirajte u autoklavu na 121 ° C 15 minuta. Ostavite da se očvrsne očvrsne u obliku bloka. Čuvajte u hladnjaku do upotrebe.

Otopite čep kada ga namjeravate koristiti. Nakon što se otopi, držite ga u vodenoj kupelji na 44-47 ° C, dok se uzorci pripremaju.

Za površinsku sjetvu

Sterilizirajte medij u autoklavu na 121 ° C, a zatim rasporedite 20 ml u sterilnim Petrijevim posudama. Ostavite da se stvrdne, preokrenite i čuvajte u hladnjaku do upotrebe.

Ploče od tempere prije upotrebe. PH sredstva treba biti 7,0 ± 0,2.

Koristiti

Standardni agar s brojevima koristi se u tehnici aerobnog mezofilnog brojanja tijekom mikrobiološke analize vode i hrane. Broj aerobnih mezofila je potreban, jer on određuje sanitarnu kvalitetu ispitivanog uzorka.

Primjena ove tehnike (korištenjem ovog medija) omogućuje makroskopsku vizualizaciju izoliranih kolonija za njihovu kvantifikaciju.

Tehnika izlivanja ploča (dubinska setva)

-Postupak

Tehnika se sastoji od sljedećeg:

1) Homogenizirati uzorak kako bi se redistribuirale prisutne bakterije.

2) Početna suspenzija izrađena je u sterilnoj bočici ili vrećici, poštujući omjer 10 gr ili 10 ml uzorka u 90 ml razrjeđivača (10 ^-1).

3) Od početne suspenzije, odgovarajuća decimalna razrjeđenja izrađuju se ovisno o vrsti uzorka. Primjer: (10 ^-2, 10 ^-3, 10 ^-4). Razrjeđenja se rade s vodom peptona ili fosfatnim puferom.

Da biste to učinili, uzmite 1 ml inicijalne suspenzije i stavite je u 9 ml razrjeđivača, nastavite razrjeđenja ako je potrebno, uzimajući 1 ml razrjeđenja 10 ^-2 i tako dalje.

4) Uzmite 1 ml svakog razrjeđenja i stavite u prazne sterilne Petrijeve posude.

5) Svakoj ploči dodajte 12 do 15 ml standardnog agarnog broja koji je prethodno rastopljen i staložen na 44 - 47 ° C.

6) Lagano zakrenite ploče da se uzorak ravnomjerno rasporedi po agaru i ostavi da se stvrdne.

7) Okrenite ploče i inkubirajte na 37 ° C u aerobiozi 24 do 48 sati.

8) Na kraju vremena ploče se ispituju i kolonije broje u razrjeđivanju koje to dopušta. Za brojanje su izabrane one ploče koje imaju između 30 i 300 CFU.

Brojanje se može obaviti ručno ili možete koristiti opremu brojača kolonije.

Dozvoljene vrijednosti za ml uzorka mogu varirati od zemlje do zemlje, ovisno o propisima kojima se na njih primjenjuje.

-Račun UFC-a

Opći izračun vrši se pomoću sljedeće formule:

Formula za opći izračun kvantifikacije CFU-a. Izvor: Državna uprava za lijekove, hranu i medicinsku tehnologiju (ANMAT). Mikrobiološka analiza hrane, službena analitička metodologija, pokazatelji mikroorganizama. 2014. svezak 3. Dostupno na: anmat.gov.ar

Rezultate izrazite s 1 ili 2 znamenke množeći s odgovarajućom bazom 10. Primjer: ako je rezultat 16.545, zaokružuje se na osnovu treće znamenke na 17.000 i bit će izražen na sljedeći način: 1.7 x 10 ⁴. Ako je rezultat 16.436, zaokružite ga na 16.000 i izrazite 1.6 x 10 ⁴.

Tehnika površinskog sjetve

-Postupak

-Inokularno s 0,1 ml izravnog uzorka ako je tekućina, početna suspenzija 10 ^-1 ili uzastopna razrjeđenja 10 ^-2, 10 ^-3 itd., U sredini standardne pločice s agarima za brojanje.

- Ravnomjerno rasporedite uzorak Drigalski lopaticom ili staklenom šipkom u obliku slova L. Ostavite ga da odstoji 10 minuta.

-Okrenite ploče i aerobno inkubirajte na 37 ° C 24 do 48 sati.

- Nastavite brojati kolonije, odaberite one ploče u rasponu između 20 - 250 CFU.

-Račun UFC-a

Za proračun se primjenjuje faktor razrjeđenja, koji je obrnut. Broj se zaokružuje na dvije značajne znamenke (zaokruživanje prema trećoj znamenci) i izražava se snagom baze 10. Na primjer, ako se u uzorku bez razrjeđivanja (10 ^-1) broji 224 CFU, prijavljuje se 22 x 10 ¹ CFU., ali ako je broj 225, navodi se 23 x 10 ¹ CFU.

Ako se u razrjeđivanje 10 ^-3 broji 199 CFU, izvijestit će se 20 x 10 ⁴ CFU, ali ako se 153 CFU ubroji u istom razrjeđivanju, bit će prijavljeno 15 x 10 ⁴ CFU.

QA

Standardni medij za obračun broja može se procijeniti korištenjem poznatih certificiranih sojeva, kao što su: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Ako se uzgojni medij nalazi u optimalnim uvjetima, očekuje se zadovoljavajući rast u svim slučajevima, osim L. fermentum, koji može imati redoviti prinos.

Za procjenu sterilnosti kultivacijskog medija, jednu ili dvije ploče svake pripremljene šarže (bez inokulacije) treba inkubirati na 37 ° C u aerobiozi tijekom 24 sata. Nakon tog vremena, u mediju se ne smije primijetiti rast ili promjena boje.

Ograničenja

-Ne rastopite agar više od jednom.

-Pripremljeni medij može izdržati do 3 mjeseca ako se čuva u hladnjaku i zaštićen od svjetlosti.

-Ovaj medij nije pogodan za zahtjevne ili anaerobne mikroorganizme.

Reference

1. Nacionalna uprava za lijekove, hranu i medicinsku tehnologiju (ANMAT). Mikrobiološka analiza hrane, službena analitička metodologija, pokazatelji mikroorganizama. 2014. svezak 3. Dostupno na: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Broj ploča agara. 2009. Dostupno na:
3. Conda Pronadisa Laboratories. Standardni metodni agar (PCA) prema APHA i ISO 4833. Dostupno na: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Broj agar ploča 2015. Dostupno na: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B i Velázquez O. 2009. Tehnike mikrobiološke analize hrane. 2. izd. Kemijski fakultet, UNAM. Meksiko. Dostupno na: depa.fquim.unam