ZIEHL-NEELSEN MRLJA: OBRAZLOŽENJE, REAGENSI I TEHNIKA - BIOLOGIJA - 2026

Ziehl-Neelsen bojanje tehnika za identifikaciju mikroorganizmi otporni na alkohol kiselina (ara). Naziv ovog postupka mikrobiologije odnosi se na njegove autore: bakteriolog Franz Ziehl i patolog Friedrich Neelsen.

Ova tehnika je vrsta diferencijalnog bojenja, koja podrazumijeva upotrebu različitih boja kako bi se stvorio kontrast između struktura koje želite promatrati, razlikovati i kasnije identificirati. Ziehl-Neelsen mrlja koristi se za identificiranje određenih vrsta mikroorganizama.

Ziehl-Neelsen mrlja

Neki od tih organizama su mikobakterije (npr. Mycobacterium tuberculosis), nokardija (npr. Nocardia sp.) I neki jednoćelijski paraziti (npr. Cryptosporidium parvum). Mnoge bakterije mogu se klasificirati pomoću uobičajene tehnike koja se naziva mrlja po Gramu.

Međutim, nekim bakterijskim skupinama potrebne su druge metode kako bi ih se moglo prepoznati. Tehnike poput mrlje Ziehl-Neelsen zahtijevaju kombinacije boja s toplinom kako bi se fiksirale na staničnu stijenku.

Zatim dolazi postupak izbjeljivanja koji omogućava dva rezultata: otpornost ili osjetljivost na promjene boje kiselinama i alkoholima.

osnova

Obrazloženje ove tehnike bojenja temelji se na svojstvima stanične stijenke tih mikroorganizama. Zid je sastavljen od vrste masnih kiselina nazvanih mikolične kiseline; Karakteriziraju ih vrlo dugački lanci.

Kad masne kiseline imaju vrlo dugu strukturu, lakše mogu zadržati boje. Neke bakterijske rodove je vrlo teško obojati po Gramu, zbog visokog sadržaja mikoličnih kiselina u staničnoj stijenci.

Ziehl-Neelsen mrlja koristi fenolni spoj karbolni fuksin, osnovnu mrlju. To ima sposobnost interakcije s masnim kiselinama stanične stijenke, koja je voskaste teksture na sobnoj temperaturi.

Bojenje karbolnim fuksinom pojačava se u prisustvu topline, jer se vosak rastopi i molekule boje brže se kreću u staničnoj stijenci.

Kiselina koja se kasnije koristi služi za uklanjanje boja koje nisu obojene jer njihov zid nije bio dovoljno povezan s bojom; prema tome, jačina kiselog izbjeljivača može ukloniti kiselo bojilo. Stanice koje se odupiru ovoj promjeni boje nazivaju se brzim kiselinama.

Sekundarna boja

Nakon dekolorizacije uzorka, u suprotnosti je s drugom bojom koja se naziva sekundarna boja. Općenito se koristi metilen plava ili malahit zelena.

Sekundarna boja mrlja pozadinski materijal i time stvara kontrast strukturama obojenim u prvom koraku. Samo obezbojene stanice apsorbiraju drugu boju (kontrasta) i poprimaju njihovu boju, dok stanice koje brze kiseline zadržavaju svoju crvenu boju.

Ovaj se postupak često koristi za identifikaciju Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium leprae, koji se nazivaju brzo kiselinskim bacilama.

Reagensi

Primarna boja

Koristi se 0,3% karbolni fuksin (filtriran). Ova se boja priprema od mješavine alkohola: fenola u etanolu (90%) ili metanolu (95%), a u toj smjesi se otopi 3 grama osnovnog fuksina.

Otopina za izbjeljivanje

U ovom se koraku mogu koristiti otopine 3% alkoholne kiseline ili 25% sumporne kiseline.

Sekundarna boja (kontra-boja)

Boja koja se najviše koristi za kontrastiranje uzoraka obično je 0,3% metilen plava. No mogu se koristiti i druge, poput 0,5% malahit zelene boje.

Tehnika

Postupak brzog bojenja u kiselinama

Pripremite bakterijski razmaz

Ova priprema se vrši na čistom, suhom toboganu, pridržavajući se mjera opreza sterilnosti.

Sušenje razmaza

Pustite da se smir osuši na sobnoj temperaturi.

Zagrijte uzorak

Uzorak treba zagrijati podmetanjem vatre na slajd ispod. Fiksacija alkohola može se izvršiti ako razmaz nije pripremljen ispljuvak (tretiran natrijevim hipokloritom da bi ga izbjeljivao) i ako se neće odmah obojiti.

M. tuberculosis uklanja se izbjeljivačem i tijekom procesa bojenja. Toplinska fiksacija neobrađenog sputuma neće ubiti M. tuberculosis, dok je fiksacija alkohola baktericidna.

Pokrijte mrlju

Mrlja je prekrivena otopinom karbolnog fuksina (primarna osnovna mrlja).

Zagrijte mrlju

To se radi za 5 minuta. Trebali biste primijetiti evoluciju pare (približno 60 ° C). Važno je ne pregrijavati i izbjegavati spaljivanje uzorka.

S obzirom na zagrijavanje mrlja, potrebno je biti vrlo oprezan pri zagrijavanju karbolnog fuksina, posebno ako se bojenje vrši na pladnju ili drugoj posudi u kojoj su sakupljene lako zapaljive kemikalije iz prethodnog bojenja.

Pod toboganima treba staviti samo mali plamen pomoću prethodno upaljenog brisa namočenog s nekoliko kapi kiselog alkohola, metanola ili 70% -tnog etanola. Izbjegavajte upotrebu velikog brisa natopljenog u etanolu jer to predstavlja požar.

Operite mrlju

Ovo pranje mora se obaviti čistom vodom. Ako voda iz slavine nije čista, oprati mrlju filtriranom ili destiliranom vodom, poželjno.

Oblog prekrijte kiselim alkoholom

Taj kiseli alkohol trebao bi biti 3%. Pokrivanje se vrši 5 minuta ili dok se razmaz dovoljno razbaruši, tj. Blijedo ružičaste boje.

Mora se uzeti u obzir da je kiseli alkohol zapaljiv; stoga se mora koristiti s velikom pažnjom. Izbjegavajte da se nalazite u blizini izvora paljenja.

Operite mrlju

Pranje treba biti čistom destiliranom vodom.

Prekrijte mrlju mrljom

To može biti malahitno zelena (0,5%) ili metilen plava (0,3%) mrlja od 1 do 2 minute, koristeći dulje vrijeme ako je mrlja tanka.

Operite mrlju

Opet treba koristiti čistu (destiliranu) vodu.

Za odvod

Stražnju stranu tobogana očistite, a mrlju stavite na odvodnu policu da se osuši na zraku (nemojte koristiti upijajući papir za sušenje).

Ispitajte razmaz pod mikroskopom

Mora se koristiti 100X objektivno i potopno ulje. Sustavno skenirajte mrlju i zabilježite odgovarajuća zapažanja.

Protumačite rezultate

Teoretski, mikroorganizmi koji oboje crvenkastu boju smatraju se pozitivno brzom kiselinom (AAR +).

Suprotno tome, ako se mikroorganizmi oboje u plavu ili zelenu boju, ovisno o boji koja se koristi kao kontra-boja, oni se smatraju kiselinom brzo negativnim (AAR-).

Reference

1. Apurba, S. i Sandhya, B. (2016). Osnove praktične mikrobiologije (1. izd.). Medicinski izdavači braće Jaypee.
2. Bauman, R. (2014). Mikrobiologija s bolestima po tjelesnom sustavu (4. izd.). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. i Killington, A. (1996). Uvodna mikrobiologija (1. izd.). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. i Morton, V. (2006). Laboratorijski priručnik i radna bilježnica iz mikrobiologije: Primjene na njegu bolesnika (11. izd.). McGraw-Hill obrazovanje.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Udžbenik mikrobiologije (1. izd.). BI publikacije PVT.