MRLJA OD GIEMSA: OBRAZLOŽENJE, MATERIJALI, TEHNIKA I UPOTREBA - BIOLOGIJA - 2025

Giemsa boja je vrsta bojanje kliničkih uzoraka, na temelju smjese kiselih i bazičnih boje. Njegovo stvaranje inspirirano je radom Romanowskog, gdje ga je Gustav Giemsa, kemičar i bakteriolog podrijetlom iz Njemačke, usavršio dodavanjem glicerola za stabilizaciju spojeva.

Promjene nastale u izvornoj Romanowskoj tehnici omogućile su značajno poboljšanje mikroskopskih opažanja, pa je tehnika krštena imenom mrlje Giemsa.

Različiti uzorci obojeni Giemsa mrljama. A. Trypanosoma evansi u perifernoj krvi. B. Normalne krvne stanice. C. Borrelia theileri u perifernoj krvi. D. Burkittov limfom.

Budući da je to jednostavna tehnika izvedbe, visoko funkcionalna i ekonomična, trenutno se široko koristi u kliničkom laboratoriju za hematološke brise, uzorke koštane srži i odsječke tkiva.

Tehnika bojenja Giemsa vrlo je korisna za citološke studije jer omogućuje promatranje specifičnih staničnih struktura. Ovom se tehnikom mrljaju citoplazme, jezgre, nukleoli, vakuole i granule stanica, čime se mogu razlikovati čak i fini tragovi kromatina.

Nadalje, mogu se otkriti značajne promjene veličine, oblika ili boje jezgre, gdje je moguće vizualizirati gubitak odnosa jezgra i citoplazma.

S druge strane, omogućava identificiranje nezrelih stanica koštane srži i periferne krvi što je važno za dijagnozu ozbiljnih bolesti poput leukemije. Također je moguće između ostalog otkriti hemoparazite, ekstra i unutarćelijske bakterije, gljivice.

U citogenetici se široko koristi, jer je moguće proučavati mitozu stanica.

Osnove bojenja Giemsa

Boje tipa Romanowsky temelje se na korištenju kontrasta između kiselih i bazičnih boja kako bi se postiglo obojenje bazične i kiselinske strukture. Kao što se može vidjeti, postoji afinitet kiselih boja za bojenje osnovnih struktura i obrnuto.

Osnovno korišteno bojilo je metilen plavo i njegovi oksidirani derivati ​​(Azure A i Azure B), dok je kiselo bojilo eozin.

Kisele strukture stanica su nukleinske kiseline, granule segmentiranih bazofila, među ostalim, stoga će biti obojene metilen plavim.

U tom istom smislu, osnovne strukture stanica su hemoglobin i neke granule, poput onih sadržanih u segmentiranim eozinofilima, između ostalog; ove će biti obojene eozinom.

S druge strane, s obzirom na to da su metilen plavi i azurni karakterizirani metakromatskim bojama, oni mogu dati različitu nijansu različitim strukturama u skladu s opterećenjem poliana koji posjeduju.

Tako strateška kombinacija bazičnih i kiselih boja uspijeva razviti širok spektar boja, prema biokemijskim karakteristikama svake strukture, hodajući blijedoplavim, tamnoplavim, ljubičastim i ljubičastim nijansama u slučaju kiselih struktura.

Dok je obojenje koje pruža eozin stabilnije, stvara boje između crveno-narančaste i lososa.

materijali

Materijali za pripremu matične otopine

Za pripremu osnovne otopine potrebno je vagati 600 mg praha Giemsa mrlje, mjerimo 500 cc metilnog alkohola bez acetona i 50 cc neutralnog glicerina.

Kako pripremiti osnovnu otopinu

Teški Giemsa prah stavite u mort. Ako postoje kvržice, treba ih prskati. Nakon toga dodajte znatnu količinu odmjerenog glicerina i vrlo dobro promiješajte. Dobivena smjesa se izlije u vrlo čistu ambre bocu.

Ostatak glicerina stavlja se u mort. Ponovo promiješajte da očistite ostatak boje koja se zalijepila za zidove maltera i ulijte u istu staklenku.

Boca se zatvori i stavi u vodenu kupelj na 55 ° C tokom 2 sata. Dok se nalazi u vodenoj kupelji, nježno protresite smjesu svakih pola sata.

Nakon toga smjesa se ostavi da se ohladi kako bi se alkohol stavio. Prije toga se dio izmjerenog alkohola stavi u mort kako bi se završilo ispiranje preostalog bojila, a zatim se dodaje u smjesu zajedno s ostatkom alkohola.

Ovaj pripravak treba ostaviti da sazrijeva najmanje 2 tjedna. Iskorišteni dio temeljne otopine treba filtrirati.

Kako bi se izbjegla kontaminacija pripravka, preporučuje se dio koji će biti u stalnoj upotrebi prebaciti u malu ambernu bočicu s kapalicom. Napunite svaki put kada reagens istječe.

Materijali za pripremu otopine pufera

S druge strane, puferska otopina pri pH 7,2 se priprema kako slijedi:

Izmjereno je 6,77 g natrijevog fosfata (bezvodnog) (NaHPO ₄), 2,59 g kalijevog dihidrogen fosfata (KH ₂ PO ₄) i destilirana voda do 1000 ccm.

Završna priprema boje

Za pripremu konačne otopine za bojenje mjeri se 2 ml filtrirane osnovne otopine i pomiješa se sa 6 ml puferne otopine. Umiješajte smjesu.

Važna činjenica koja se mora uzeti u obzir je da se tehnike pripreme obojenja mogu mijenjati ovisno o trgovačkoj tvrtki.

Dodatni materijali potrebni za obavljanje bojanja

Osim opisanih materijala, za pranje morate imati mostove za bojanje, majice s vodom ili tamponima, predmetne tobogane ili poklopce za predmete, štopericu za kontrolu vremena bojanja i papir za razmazivanje ili neki drugi materijal koji se može koristiti za sušenje (gaza ili pamuk).

Tehnika

Postupak bojenja

1) Prije bojenja, mrlja uzorka mora biti spremna na čistom stakalcu.

Uzorci mogu biti krv, koštana srž, histološki odsjeci tkiva ili cerviko-vaginalni uzorci. Preporučuje se da namazi budu tanki i imaju 1 ili 2 sata sušenja prije bojenja.

2) Na most za bojenje stavite sve listove koji moraju biti obojeni. Uvijek radite istim redoslijedom i svaki je list dobro identificiran.

3) Stavite nekoliko kapi 100% metilnog alkohola (metanol) na bris i ostavite da djeluje 3 do 5 minuta, kako bi se uzorak učvrstio i dehidrirao.

4) Odbacite metanol prisutan na lim i ostavite da se osuši na zraku.

5) Jednom kada se osuši, stavite konačnu otopinu za bojenje kapalicom, dok ne bude pokriven čitav list. Ostavite da djeluje 15 minuta. Neki autori preporučuju do 25 min. Ovisi o poslovnoj kući.

6) Otopite mrlju i isperite mrlju destiliranom vodom ili 7,2 puferskom otopinom.

7) Na papiru za umetanje pustite da se listovi osuše na otvorenom, poredani okomito uz pomoć potpornja.

8) Očistite stražnji dio tobogana alkoholnim ili pamučnim tamponom kako biste uklonili tragove mrlja.

komunalne usluge

Tehnika bojenja Giemsa koristi se u raznim područjima, među kojima su: hematologija, mikologija, bakteriologija, parazitologija, citologija i citogenetika.

Hematologija

To je najčešća upotreba koja se daje ovoj mrlji. Pomoću nje može se identificirati svaka stanica koja se nalazi u uzorcima koštane srži ili periferne krvi. Kao i procjenu broja svake serije, mogućnost otkrivanja leukocitoze ili leukopenije, trombocitopenije itd.

Budući da je osjetljiv na prepoznavanje nezrelih stanica, relevantan je u dijagnostici akutne ili kronične leukemije. Također je moguće postaviti dijagnozu anemije, poput srpaste ćelije, između ostalog.

Mikologija

U ovom je području njegova upotreba uobičajena za traženje Histoplasma capsulatum (unutarćelijske dimorfne gljivice) u uzorcima tkiva.

bakteriologija

U hematološkim mrljama obojenim lijekom Giemsa moguće je otkriti Borrelias sp u bolesnika koji su prisutni s bolešću koja se zove recidivna groznica. Spiroheta ima u izobilju među eritrocitima, u uzorcima uzetim na vrhuncu groznice.

Moguće je i vizualizirati unutarćelijske bakterije poput Rickettsia sp i Chlamydia trachomatis u zaraženim stanicama.

parazitologija

Na području parazitologije, bojenje Giemsa omogućilo je dijagnosticiranje parazitskih bolesti poput malarije, Chagasove bolesti i leishmaniasis.

U prva dva parazita Plasmodium sp i Trypanosoma cruzi mogu se vidjeti u perifernoj krvi zaraženih pacijenata, mogu se naći u različitim fazama, ovisno o fazi u kojoj se nalazi bolest.

Da biste poboljšali potragu za parazitima u krvi, preporuča se koristiti mrlju Giemsa pomiješanu s mrlju May-Grünwald.

Isto tako, kožna lajmanijaza može se dijagnosticirati procjenom uzoraka biopsije obojene Giemsa gdje je parazit pronađen.

Citologija

Bojenje Giemsa koristi se i za citološko ispitivanje endocervikalnih uzoraka, mada to nije najčešće korištena tehnika u tu svrhu.

Ali u slučajevima oskudice resursa može se koristiti, imajući sličnu funkcionalnost kao i Papanicolaou tehnika i po nižim troškovima. Međutim, za ispitivanje je potrebna stručnost.

citogenetika

Važna karakteristika bojanja Giemsa je njegova sposobnost da se veže snažno za adeninske i timinske dijelove DNA. To omogućava vizualizaciju DNK tijekom stanične mitoze u različitim stanjima kondenzacije.

Ova su istraživanja potrebna za otkrivanje kromatskih aberacija poput duplikacija, brisanja ili translokacija različitih regija kromosoma.

Istraživanje koje pokazuje efikasnost mrlje od Giemsa

Cannova i sur. (2016), uspoređivali su 3 tehnike bojenja za dijagnozu kožne leishmaniasis.

Za to su koristili uzorke dobivene od pokusne životinje (Mesocrisetus auratus) eksperimentalno inokulirane Leishmaniasom.

Autori su pokazali da je Giemsa mrlja bolja od mrlje Pap-mart® i Gaffney. Stoga su mrlju Giemsa smatrali idealnom za dijagnosticiranje kožne lišmanijoze.

Izvrsni rezultati koje su dobili autori rezultat su činjenice da kombinacija boja koja čine Giemsa smjesu daje potrebne uvjete za stvaranje povoljnog kontrasta, omogućujući jasno razlikovanje struktura amastigota i unutarćelijskih i izvanstanično.

I druge tehnike (Pap-mart® i Gaffney) to su učinile, ali na slabiji način i zato ih je teže vizualizirati. Zbog toga se mrlja Giemsa preporučuje za parazitološku dijagnozu leishmaniasis.

Isto tako, studija Ramírez i suradnika (1994) procijenila je valjanost mrlja Giemsa i Lendrum u konjunktivnim mrljama za identifikaciju Chlamydia trachomatis.

Autori su utvrdili da mrlje Giemsa i Ledrum imaju jednaku specifičnost, ali je otkriveno da je Giemsa osjetljivija.

To objašnjava zašto se mrlja Giemsa trenutno najčešće koristi za dijagnozu klamidijskih infekcija, osobito ako ima malo sredstava.

Izvor: PanReac Applicationhem ITW reagensi. Mrlja od Giemsa. Verzija 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Španjolska.

Preporuke za dobro bojenje

Ne treba ubrzavati sušenje listova. Za sušenje na otvorenom treba očekivati ​​dovoljno vremena. Otprilike 2 sata.

Boja odmah nakon 2 sata za najbolje rezultate.

Da bi se mrlje bolje fiksirale i zaprljale, uzorak se mora raspodijeliti na stakalcu na takav način da ostane tanak i jednolik sloj.

Poželjni uzorak krvi je kapilarni, jer se razmaz izrađuje izravno iz kapi krvi, pa uzorak ne sadrži nikakve aditive, što pogoduje održavanju staničnih struktura.

Međutim, ako se koristi venska krv, EDTA treba koristiti kao antikoagulans, a ne heparin, jer heparin obično deformira stanice.

Česte pogreške u bojenju na Giemsi

U praksi ove bojenja mogu se učiniti pogreške. O njima svjedoče nagle promjene tonaliteta struktura.

Izuzetno plavo bojanje

To može biti zbog:

• Vrlo gusti razmazi
• Prekoračenje vremena bojenja
• Oprati se nedovoljno.
• Upotreba reagensa znatno iznad neutralnog (alkalnog) pH.

Pod tim uvjetima, boje sljedećih struktura su izobličene, na takav način da će eritrociti umjesto obojenog losos-ružičasto izgledati zeleno, granule eozinofila koje moraju biti obojene opekom crveno postat će plavkasto ili sivo i tako dalje odstupanje u uobičajenim tonovima.

Pretjerano ružičasto bojanje

To može biti zbog:

• Nedovoljno vremena bojenja.
• Dugo ili prekomjerno pranje.
• Loše sušenje.
• Upotreba visoko kiselih reagensa.

U ovom slučaju, strukture koje obično oboje plavu boju neće biti gotovo vidljive, dok će strukture koje oboje ružičasto imati jako pretjerane nijanse.

Primjer: Eritrociti će postati svijetlo crveni ili narančasti, nuklearni kromatin će se pojaviti blijedo ružičast, a granule eozinofila će obojati duboko svijetlo crvenu boju.

Prisutnost taloga u razmazu

Uzroci mogu biti:

• Koristite prljave ili slabo isprane filmove.
• Ne dopustite da se miris dobro osuši.
• Ostavite rješenje za pričvršćivanje predugo.
• Neadekvatno pranje na kraju bojenja.
• Neodgovarajuća filtracija ili ne filtriranje obojenog obojenja.

Prisutnost morfoloških artefakata

Morfološki artefakti mogu se pojaviti u mrljama, što otežava vizualizaciju i interpretaciju prisutnih struktura. To je zbog:

• Vrsta antikoagulansa koji se koristi, poput heparina.
• Koristite prljave, pokvarene ili masne filmove.

Način pohrane

Nakon pripreme, bojilo se mora čuvati na sobnoj temperaturi (15 - 25 ° C) kako se spriječi taloženje boje. Treba ga čuvati u dobro zatvorenom spremniku s jantarima.

Reference

1. Cannova D, Brito E i Simons M. Procjena tehnika bojenja za dijagnozu kožne leishmaniasis. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. PanReac Applicationhem ITW reagensi. Mrlja od Giemsa. Verzija 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Španjolska.
3. Clark G. Postupci bojenja (1981), 4thed. Williams i Willkins.
4. Primjena kliničke kemije. Mrlja od Giemsa za in vitro dijagnostiku. Distributer: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F i Grazioso C. Valjanost mrlja Giemsa i Lendrum u konjunktivnim mrljama za identifikaciju Chlamydia trachomatis. Bol iz Sanit Panama. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G. Opća mikologija. 1994. Drugo izdanje Središnjeg sveučilišta u Venezueli, izdanja biblioteka. Venezuela Caracas.
7. "Mrlja od Giemsa." Wikipedia, Slobodna enciklopedija. 1. rujna 2017., 01:02 UTC. 6. prosinca 2018., es.wikipedia.org.