BOJENJE SPORA: OBRAZLOŽENJE, TEHNIKE I UPOTREBE - BIOLOGIJA - 2025

Spora bojenje je metodologija boja otpornih strukture koje čine neku bakterijsku rodova kad u nepovoljnim uvjetima; Te strukture odgovaraju obliku preživljavanja.

Postoji mnogo rodova koji tvore spore; međutim, glavni su Bacillus i Clostridium. Ti se rodovi smatraju relevantnijim, jer imaju patogene vrste za ljude.

Bojenje spora pomoću Shaeffer - Fulton ili Wirtz-Conklin metode. I tambe (izvorni upload), s Wikimedia Commonsa

Svaka bacila može stvoriti spore. U vrijeme bojenja pripravka, spore se mogu naći unutar bacila (endospore) ili izvan njega (exospore). Uz konvencionalne tehnike bojenja na bakterije - poput mrlje po Gramu - spore ostaju bezbojne.

Trenutno postoji nekoliko metodologija bojenja koje su sposobne prodirati u gustu strukturu spora kako bi se obojale. Te su metodologije vrlo raznolike; To uključuje Dorner-ovu tehniku, Möellerovu mrlju i Shaeffer-Fulton metodologiju, poznatu i pod nazivom Wirtz-Conklin.

Od svih spomenutih tehnika, Shaeffer-Fulton metodologija se najčešće koristi u rutinskim laboratorijima. Ime je dobio po dvoje mikrobiologa koji su stvorili kolorit 1930. godine: Alicia Shaeffer i MacDonald Fulton. Međutim, tehnika se ponekad naziva Wirtz-Conklin po dvojici bakteriologa iz 1900-ih.

osnova

Spore se ne mrlje uobičajenim mrljama, jer imaju vrlo gust zid. Složen sastav spore sprječava ulazak većine bojila.

Ako se spore proučavaju izvana, primjećuju se sljedeći slojevi: prvo je tu egzosporij, koji je najtanji i vanjski sloj koji nastaje od glikoproteina.

Slijedi kutikula koja pruža otpornost na visoke temperature, a slijedi korteks sastavljen od peptidoglikana. Kasnije je zid baze koji štiti protoplast.

Spora je dehidrirana struktura koja sadrži 15% kalcija i dipikolinske kiseline. Stoga se većina tehnika bojenja spora oslanja na primjenu topline kako bi boja mogla prodrijeti u gustu strukturu.

Jednom kada se spore zaprljaju, boja ne može ukloniti. U tehnici Shaeffer - Fulton, malahitna zelena ulazi u vegetativne ćelije i, kada se primijeni toplina, prodire u endospor kao i u egzospore.

Ispiranjem vodom, boja se uklanja iz vegetativne stanice. To se događa jer je malahit zelena boja malo bazična, pa se slabo veže na vegetativnu stanicu.

Umjesto toga, ne može izaći iz spora i na kraju se bacili suprotstavljaju safraninu. Ovaj temelj vrijedi za ostale tehnike u kojima se događa nešto slično.

Tehnike bojenja spora

Za provođenje bojenja spora mora se dobiti čista kultura sumnjivog soja koji se proučava.

Kultura je izložena ekstremnim temperaturama tijekom 24 sata kako bi se mikroorganizam potaknuo da sporuli. Za to se kultura može staviti u pećnicu na 44 ° C ili u hladnjak (8 ° C) na 24 ili 48 sati.

Ako se predugo ostavi na spomenutim temperaturama, promatrat će se samo egzospore jer su svi endospore već izašli iz bacila.

Na kraju vremena, nekoliko kapi sterilne fiziološke otopine treba staviti na čisti tobogan. Potom se uzme mali dio kulture i napravi se fino širenje.

Nakon toga se ostavlja da se osuši, učvrsti na toplini i oboji jednom od tehnika objašnjenih u nastavku:

Dorner tehnika

1- Pripremite koncentriranu suspenziju sporuliranog mikroorganizma u epruveti u destiliranoj vodi i dodajte jednaku količinu filtriranog Kinyoun karbol fuksina.

2- Stavite epruvetu u kupku s kipućom vodom između 5 i 10 minuta.

3- Na čistom stakalcu pomiješajte kap prethodne suspenzije s kapljicom 10% vodene otopine nigrosina, prokuhajte i filtrirajte.

4- Raširite i sušite na laganoj vatri.

5- Ispitajte sa ciljem 100X (uranjanje).

Spore mrlje crveno, a bakterijske stanice izgledaju gotovo bezbojno na tamno sivoj pozadini.

Izmijenjena Dorner tehnika

1- Suspenzija sporuliranog mikroorganizma širi se na klizaču i učvrsti na toplini.

2- Uzorak se prekrije trakom filtrirajućeg papira kojoj se dodaje karbolni fuksin. Bojenje se zagrijava 5 do 7 minuta plamenom Bunsenovog plamenika dok se ne stvori evolucija para. Zatim se papir uklanja.

3- Pripravak se ispere vodom, a zatim osuši s upijajućim papirom.

4- Pokrijte razmaz tankim filmom 10% nigrosina, koristeći drugi tobogan za širenje nigrosina ili iglom.

Obojenje spora i bakterija je isto kao što je opisano u stanju tehnike.

Shaeffer - Fulton ili Wirtz-Conklin tehnika

1- Napravite fini mrlja suspenzijom sporuliranog mikroorganizma na stakalcu i fiksirajte na toplinu.

2- Prekrijte tobogan 5% -tnom vodenom vodenom otopinom malahita (na to možete staviti filter papir).

3- zagrijati plamen Bunsenovog plamenika da uzrokuje oslobađanje para i ukloni plamen. Ponovite operaciju 6 do 10 minuta. Ako otopina malahita zelena ispari tijekom postupka, može se dodati više.

4- Izvadite filter papir (ako je ugrađen) i operite vodom.

5- Prekrijte staklo s 0,5% vodenim safraninom 30 sekundi (neke varijante tehnike koriste 0,1% vodeni safranin i ostavite ga 3 minute).

Ovom tehnikom spore se pojavljuju zeleno, a bacili crveno.

Ima nedostatak što endospore mladih kultura ne mrljaju dobro, budući da djeluju izrazito bistro ili bezbojno. Da bi se to izbjeglo, preporučuje se korištenje kultura inkubacije u trajanju od 48 sati.

Möellerova tehnika

1- Prekrijte razmaz kloroformom 2 minute.

2- Odbacite kloroform.

3- Pokrijte 5 minuta kromiranom kiselinom.

4- Operite destiliranom vodom

5- Plahta je prekrivena karbolnim fuksin-fenicadom i izložena plamenu Bunsenovog plamenika dok ne ispušta pare; zatim se na trenutak uklanja s plamena. Operacija se ponavlja sve dok se ne završi 10 minuta.

6- Operite vodom.

7- Upotrijebite zakiseljeni etanol (klorovodični alkohol) za uklanjanje boje. Ostaje 20 ili 30 sekundi.

8- Operite destiliranom vodom.

9- kontrastatirajte tako da pokrivate list metilen plavim 5 minuta.

10- Operite destiliranom vodom.

11- Ostavite da se osuši, a uzorak se uzme na mikroskop.

Spore su crvene boje, a bacili plavi. Važno je da ne udišete pare, jer su otrovne i dugoročno mogu biti kancerogene.

Modificirana Möellerova tehnika bez vrućine

Hayama i njegovi suradnici su 2007. stvorili modifikaciju Möellerove tehnike. Eliminirali su korak zagrijavanja boje i zamijenili ga dodavanjem 2 kapi površinski aktivnog sredstva Tergitol 7 na svakih 10 ml otopine karbol fuksin-karbola. Dobijeni su isti rezultati.

Prijave

Obojenje spora daje vrlo vrijedne i korisne informacije za identifikaciju patogena, budući da su njegova prisutnost, oblik, položaj unutar bacila i sposobnost deformacije vegetativne stanice ili ne, podaci koji mogu voditi vrste uključeni unutar određenog žanra.

U tom kontekstu vrijedi reći da spore mogu biti okrugle ili ovalne, mogu se nalaziti u središtu ili također u paracentralnom, subminalnom ili terminalnom položaju.

Dijagram oblika i položaja endospora i egzospora

Primjeri

- Clostridium difficile tvori ovalnu sporu u terminalnom položaju koja deformira bacil.

- Spora Clostridium tertium je ovalna, ne deformira bacil i nalazi se na terminalnoj razini.

- Endospor Clostridium tetani je terminalni i deformira bacil, dajući izgled bubnjića.

- Spore Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy i C. septicum su okrugle ili subterminalne ovalne i deformiraju bacil.

- Endospor Clostridium sordelli smješten je u središnjem položaju, s blagom deformacijom.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. (5. izd.). Argentina, uredništvo Panamericana SA

Reference

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Prijedlog pojednostavljene tehnike bojenja bakterijskih spora bez primjene topline - uspješna modifikacija Moellerove metode. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Saradnici Wikipedije. Moellerova mrlja. Wikipedia, Slobodna enciklopedija. 3. studenog 2018., 03:28 UTC. Dostupno na: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Priručnik za mikrobiološke tehnike. Odjel za osnovne znanosti Akademija mikrobiologije. Nacionalni politehnički institut.
4. "Endospore". Wikipedia, Slobodna enciklopedija. 25. veljače 2018., 10:20 UTC. 10. siječnja 2019. godine, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J i suradnici. (2006). Laburističko osoblje autonomne zajednice Extremadura. Specifični dnevni red Svezak IV. Uredništvo MAD. Seville-Spain, pp 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006.) Specijalistički laboratorijski tehničar, Galicijska zdravstvena služba (SERGAS). Posebni svezak dnevnog reda 2. Uredništvo MAD. Sevilja-Španjolska, str. 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. (5. izd.). Argentina, uredništvo Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiološka dijagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Uredništvo Panamericana SA