REDOSLIJED DNK: MAXAM-GILBERT, METODA I PRIMJERI - BIOLOGIJA - 2026

DNA sekvenciranje (deoksiribonukleinska kiselina) je postupak u laboratorijima molekularne biologije koji omogućuje da se zna redoslijed nukleotida u genetski materijal od interesa. Nadalje, sekvenciranje RNA (ribonukleinska kiselina) se također može otkriti.

Ova je tehnika bila neophodna za razvoj bioloških znanosti. Također je primjenjivo na druga područja znanja - na primjer, medicinsku dijagnozu i forenzičke istrage.

Izvor: pixabay.com

Prije se sekvence DNA lanca smatralo sporom i skupom aktivnošću, što je omogućilo identifikaciju samo nekoliko baznih parova u oligonukleotidima.

Danas, uz sav napredak znanosti, sekvenciranje DNK rutinska je operacija u mnogim laboratorijima širom svijeta zahvaljujući doprinosu gotovo 50 godina istraživanja na ovom polju. U pogledu duljine lanca, do nekoliko milijuna parova baza može se sekvencirati u vrlo kratkom vremenu.

Da biste to učinili, razvijene su desetke tehnika koje se razlikuju u cijeni i preciznosti. U ovom ćemo članku opisati i klasične i moderne tehnike, svaka sa svojim prednostima i nedostacima.

Do sada, tehnike sekvenciranja omogućuju dobivanje slijeda cjelovitih genoma, od malih prokariota i kvasca do ljudskog genoma.

Struktura DNK

Da bismo razumjeli metode i tehnike koji se koriste za sekvenciranje DNK, potrebno je poznavati određene ključne aspekte strukture i sastava molekule.

DNK je biomolekula koja se nalazi u svim živim bićima, od bakterija do velikih vodenih životinja. Organele - poput mitohondrija i kloroplasta - u sebi imaju kružnu molekulu DNK. Čak i kod nekih virusa pronađeni genetski materijal je DNA.

Strukturno gledano, DNA je skup nukleotida. Svaka se sastoji od ugljikohidrata, dušične baze (A, T, C ili G) i fosfatne skupine. Cilj slijedanja DNA je otkrivanje redoslijeda u kojem su četiri dušične baze pronađene u slijedu.

Povijest

Sredinom 1950-ih, istraživači Watson i Crick opisali su strukturu DNK kristolografskim tehnikama. Međutim, nijedan od tih istraživača nije uspio pronaći način kako otkriti slijed.

Iako je bilo određenih prethodnika, najvažniji događaj bilo je stvaranje metode Sanger, 1977. Frederick Sanger, otac metode, bio je britanski biokemičar, dobitnik dviju Nobelovih nagrada za svoj ogroman doprinos biološkim znanostima.

Ova tehnika je u literaturi poznata i kao "prekid lanca" ili dideoksinukleotidi. Principi ove tehnike i oni koji su razvijeni na temelju njenog poboljšanja i inovacija bit će opisani u nastavku.

Sanger metoda

Razvoj Sangerove metode predstavljao je ključni događaj u molekularnoj biologiji. Uključuje osnovne komponente procesa replikacije DNK koji se obično događa u stanici, ali dodaje posebnu komponentu: dideoksinukleotide.

Glavne komponente reakcije

- DNK polimeraza: Enzim DNK polimeraza presudan je element procesa. Ova molekula sudjeluje u replikaciji lanca DNA, a njegova uloga je sinteza novog lanca, spajanje trifosfatnih deoksiribonukleotida s komplementarnim.

Podsjetimo da se u DNK timini (T) spajaju s adeninima (A) kroz dvije vodikove veze, dok citozin (C) to čini s gvaninom (G) kroz tri veze.

- Nukleotidi: Sigurnije sekvenciranje uključuje dvije vrste nukleotida, četiri 2'-deoksinnukleotida (skraćeno dATP, dGTP, dCTP i dTTP) i četiri dideoksinukleotida (ddATP, ddGTP, ddCTP i ddTTP).

Iako su dideoksinukleotidi slični monomerima koji se normalno ugrađuju u DNK, u njihovoj strukturi nedostaje -OH skupina. To onemogućuje dodavanje novog nukleotida u lanac.

Stoga, kada se posebnom nukleotidu doda - na sasvim slučajni način - lancu u formaciji, sinteza se paralizira. Dakle, na kraju reakcije postoje lanci različitih veličina, svaki od kojih je reakcija zaustavljena u različitoj točki.

Eksperimentalno su pripremljena četiri ispitivanja. Svaka sadrži DNK izdvojen iz biološkog uzorka koji nas zanima, normalne nukleotide i jedan od četiri posebna tipa nukleotida. Ili su posebni nukleotidi označeni nekom vrstom fluorescentnog markera (vidi dolje automatizirano sekvenciranje).

Čitanje rezultata

Prvi korak je odvajanje svakog od sintetiziranih lanaca prema njihovoj veličini. Neke će biti duže od drugih, ovisno o tome gdje su posebne baze ugrađene.

Postoje različite biokemijske tehnike koje omogućuju odvajanje sastojaka smjese koristeći veličinu kao diskriminatorno svojstvo. Kod Sangerove metode različiti se lanci elektroforezom odvajaju. U sofisticiranijim varijantama tehnike koristi se kapilarna elektroforeza.

Dakle, duži pramenovi putuju manje od kraćih varijanti. Ovaj sustav tada prolazi kroz čitač koji prepoznaje marker koji je uključen u svaki dideoksinukleotid. Na taj se način može znati redoslijed slijeda.

Ova "prva generacija" tehnika može čitati fragmente DNK ne veće od 1 kilobaza. Trenutno se Sanger metoda koristi u raznim laboratorijima, općenito u svojim modernim varijantama. Pored toga, koristi se za potvrđivanje rezultata dobivenih najsloženijim tehnikama - ali manje preciznim.

Automatsko sekvenciranje

Kada je potrebno sekvenciranje u velikoj mjeri, postupak se ubrzava automatizacijom. To je varijacija metode zaustavljanja Sangerovog lanca, gdje su temeljni premazi označeni fluorescentnim proizvodima da bi se razlikovali.

Nakon toga, reakcijski produkt se pokreće elektroforezom - i sve na jednoj stazi. Kako svaki fragment izlazi iz posljednjeg dijela gela, brzo se prepoznaje njegovom fluorescentnom oznakom, s pogreškom oko 1%.

Najsofisticiraniji sustavi imaju sustav do 96 kapilarnih cijevi kojima upravlja računalo spojeno na robota. Odnosno, 96 uzoraka DNA može se istovremeno testirati. Dakle, postupak koji uključuje elektroforezu i analizu rezultata u potpunosti je automatiziran.

U jednom danu ti sustavi mogu slijediti do 550.000 baza. Tijekom postupka ljudski rad je nepotreban, potrebno je samo oko 15 minuta za pokretanje metode.

Maxam-Gilbert sekvenciranje

U isto vrijeme kad je Sanger objavio svoje djelo, dva istraživača Allan Maxan i Walter Gilbert uspjeli su razviti drugu metodu za dobivanje slijeda DNK. Metoda je tada stekla popularnost, ali je kasnije izmijenjena poboljšanjem Sangerove metode.

Suprotno od Sangerove metode, Maxan i Gilbert sekvencioniranje (ili kemijsko sekvenciranje, kao što je poznato) ne uključuje reakcije hibridizacije. Metodologija se sastoji od označavanja reaktivnim sredstvima na jednom kraju, nakon čega slijedi postupak pročišćavanja.

Jedan od negativnih aspekata ove tehnike leži u njezinoj ogromnoj složenosti i korištenju kemikalija koje su opasne za korisnika. Kemijski prekidi inducirani su primjenom DMS, mravlje kiseline, hidrazina i hidrazina sa solima.

Postupak

Protokol započinje s označavanjem na 5 'kraju niti i fosfornim markerom 32, zatim dolazi do kemijske modifikacije dušične baze i odvaja se. Napokon dolazi do cijepanja abasicke regije.

Najprije skratite niz koji želite slijediti na manje segmente. Ovaj se korak izvodi s restrikcijskim enzimima, što rezultira izbočenim krajevima.

Zatim se reakcija provodi s alkalnom fosfatazom, čija je svrha uklanjanje fosfatne skupine. Stoga se polinukleotid kinaza može upotrijebiti za označavanje.

Lanac je denaturiran (dvije žice su otvorene). Zatim se primjenjuju kemikalije. Te reakcije cijepanja se provode na kontrolirani način i poznato je koje vrste veza se primjenjuju kemijski.

Čitanje rezultata

Kao i kod Sangerove metode, očitavanje rezultata uključuje odvajanje prema veličini lanaca dobivenih u elektroforeznom sustavu. Sustavi sastavljeni od poliakrilamida omogućuju dobivanje vrlo odgovarajuće razlučivosti za očitanje gela.

Masovno sekvenciranje

Masovno sekvenciranje obuhvaća niz novih metoda, skraćeno kao NGS, s engleskog "Sljedeća generacija".

Metode klasificirane kao NGS zahtijevaju prethodni korak amplifikacije DNA (ne djeluju s jednom molekulom). Nadalje, korištene platforme vrlo se razlikuju. Niže će biti opisani principi najpopularnijih metoda:

Pyrosequencing

To uključuje praćenje oslobađanja pirofosfata, koje se događa svaki put kada se u lancu DNA doda novi nukleotid. Sustav enzima povezan je tako da se emisija svjetlosti (koju kamera može otkriti) događa svaki put kada se ugradi novi nukleotid.

Proces započinje zasebnom inkubacijom svake dušične baze kako bi se provjerilo postoji li ili ne. Piroakviranjem se mogu čitati dugi nizovi, ali pronađena stopa pogreške je visoka.

Sintezno sekvenciranje

To uključuje ugradnju obilježenih nukleotida. Te se fluorescentne komponente dodaju, isperu i uočljiv je ugrađeni nukleotid. Zatim se nukleotidna naljepnica uklanja i sinteza niti se može nastaviti. U sljedećem koraku također će se uključiti obilježeni nukleotid, a gore navedeni koraci će se ponoviti.

Nedostatak ove tehnike nastaje kada fluorescentni markeri nisu potpuno uklonjeni. Ove emisije stvaraju pozadinske pogreške, što rezultira značajnim pogreškama.

Sekvence vezanja

Ova se tehnika razlikuje od ostalih, jer ne koristi DNK polimerazu. Umjesto toga, ključni enzim za ovu metodologiju je ligaza. Ovdje se koriste fluorescentno obilježeni fragmenti DNK, to ih povezuje enzim i otkriva.

Najveći problem ove tehnike je kratka duljina fragmenta koju je moguće obraditi.

Redoslijed izmjenjivanja tona

Ova se tehnika temelji na mjerenju H ⁺ iona koji se oslobađa svaki put kada se uvede novi nukleotid. Princip je prilično sličan piroakciji, ali mnogo jeftiniji.

Primjeri

Sekvenciranje ljudskog genoma

Redoslijed ljudskog genoma bio je jedan od najperspektivnijih izazova u biologiji, kao i jedno od najcjenjenijih rivalstava u povijesti znanosti. Zapravo, za znanstvenike koji su bili uključeni u projekt, redoslijed genoma postao je konkurencija.

1990. pokrenuo je ono što se nazivalo "projektom ljudskog genoma", a vodio ga je poznati znanstvenik, dobitnik Nobelove nagrade James Watson. Nakon godinu dana, 1991. godine, Venter je preuzeo izazov "pobijediti" Watsona i slijediti genom prije njega. Međutim, 1992. Watson se povukao i zapovjedništvo je preuzeo drugi istraživač.

Godine 1995. Venter je objavio svoj uspjeh u potpunom sekvenciranju bakterijskog genoma metodom slučajnog sekvenciranja. Slično tome, protivnički je tim objavio godinu kasnije sekvenciju genoma kvasca.

2000. godine stekao je diplomu. Obje su tvrtke objavile preliminarne rezultate čitavog genoma u dva najprestižnija znanstvena časopisa: Nature i Science.

Ipak, znanstvenici su nastavili raditi na poboljšanju prijedloga, a 2006. godine završeni su nizovi određenih humanih kromosoma.

Važnost i primjene

Poznavanje redoslijeda nukleotida tako važne molekule kao što je DNK vrijedno je za biologe i srodne stručnjake. Ovaj lanac polinukleotida sadrži sve informacije potrebne za razvoj i održavanje svih oblika života.

Iz tih razloga je znanje o ovom nizu ključno za biološka istraživanja. U osnovi, sekvenciranje omogućava mjerenje jednog od najvažnijih svojstava bioloških sustava i utvrđivanje razlika među njima.

Sekvenciranje široko koriste taksonomisti i sistematičari, budući da određene DNK sekvence omogućuju utvrđivanje kriterija za zaključivanje da li dva organizma pripadaju istoj vrsti ili ne, uz to što mogu predložiti hipoteze o filogenetskim odnosima među njima.

Uz to, sekvenciranje DNK ima primjenu u medicini i dijagnostici. Na primjer, postoje jeftini i pristupačni sustavi koji sekvenciranjem omogućuju procjenu tendencije razvoja određenih bolesti (poput raka) primjenom takozvanih polimorfizama s jednim nukleotidom (SNPs).

Istraživanja kriminalnog i forenzičkog tipa također su obogaćena tehnikama sekvenciranja, što se može iskoristiti kao pouzdan dokaz o sudjelovanju određene osobe u zločinu.

Reference

1. Heather, JM, i Chain, B. (2016). Slijed sekvenci: povijest sekvence DNA. Genomics, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). Revolucija sekvenciranja nove generacije i njezin utjecaj na genomiku. Stanica, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Znanstvena rivalstva. Od Galilea do projekta ljudskog genoma. Uredništvo Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, AR (1977). Sekvenciranje DNK s inhibitorima koji završavaju lancem. Zbornik Nacionalne akademije znanosti, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Sljedeće generacije slijedeće transformiraju današnju biologiju. Metode prirode, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (ur.). (2014). Sljedeće generacije. Caister Academic Press.