OKSIDAZNI TEST: OBRAZLOŽENJE, POSTUPAK I UPOTREBE - BIOLOGIJA - 2026

Test oksidaze je dijagnostička metoda koja pokazuje prisutnost enzimskog kompleksa zvanog citokrom oksidaza c. Ovaj sustav inducira transformaciju reduciranog citokroma u oksidirano, jer on skuplja kisik, a on zauzvrat djeluje kao posljednji akceptor elektrona (H ⁺) u respiratornom lancu.

Izraz oksidaza skraćen je način na koji se odnosi na enzim citokrom oksidaza, također poznat kao indofenol oksidaza. U stara vremena se vjerovalo da su enzimi citokrom oksidaza i indofenol oksidaza dva različita enzima, ali danas se zna da su isti.

Pozitivan i negativan test oksidaze. Izvor: Nije naveden autor čitljiv autor. Alpha.prim ~ commonswiki pretpostavljen (na temelju tvrdnji o autorskim pravima).

Sa svoje strane, citokromi su hemoproteini koji sadrže željezo i dovršavaju sustav citokrom oksidaze. Citohromi se mogu razlikovati od vrste do vrste.

Postoje različite vrste citokroma (citohromi a1, a2, a3 i 0). Neke bakterije mogu proizvesti samo jednu, a druge do dvije ili tri istodobno. U tom je smislu prisutnost citokroma a i a3 poznata kao citokrom oksidaza c. Ovo je vrsta citokroma koju detektira oksidazni test.

Rodovi Neisseria i Pseudomonas sadrže citokrom oksidazu c. Ovi rodovi daju pozitivan test oksidazi, pomažući ih razlikovati od rodova Acinetobacter i Stenotrophomonas.

Postoje i drugi rodovi koji su pozitivni na oksidazu.

osnova

Karakteristike citokrom oksidaze c sustava

Sustav citokrom oksidaze c djeluje na sljedeći način: mikroorganizmi pozitivni na oksidazu koriste kisik za stvaranje energije aerobnim disanjem. Ovaj sustav djeluje zahvaljujući transportu elektrona od donorskih tvari poput NADH ⁺ do recepcijskih tvari, u ovom slučaju kisika.

To rezultira proizvodnjom energije (ATP) i vode ili vodikovog peroksida, ovisno o sustavu citokrom oksidaze koji mikroorganizam posjeduje.

Zbog toga je većina oksidaznih pozitivnih bakterija također pozitivna na katalazu, što je nužan uvjet za uklanjanje nastalog vodikovog peroksida, jer je ta tvar toksična za bakterije.

Citohrom oksidaza c sustav prisutan je u nekim aerobnim bakterijama, nekim fakultativnim anaerobima, malo mikroaerofilnih i nema strogih anaeroba. Potonje je razumljivo, jer strogi anaerobi ne mogu živjeti u prisutnosti kisika, stoga im nedostaje sustav citokrom oksidaze.

Princip ispitivanja

U ovom se ispitivanju koriste tvari koje djeluju kao umjetni akceptori elektrona, zamjenjujući one prirodne u lancu prijevoza elektrona.

Uglavnom se koriste boje poput parafenilendiamina i indofenola, koje djeluju kao supstrati receptora i umjetni davatelji elektrona.

Parafenilendiamin oksidira sustavom citokrom oksidaze c. Boja u smanjenom obliku je bezbojna, ali u oksidiranom obliku je obojena.

Tako se pokazuje prisutnost citokrom oksidaze c sustava; budući da će pozitivna reakcija stvoriti boju lavande ili plavo ljubičastu boju, ovisno o korištenom reagensu.

S druge strane, ako se posljednja tvar koja prima elektron u respiratornom lancu razlikuje od kisika, test oksidaze bit će negativan (nema proizvodnje boje); to je slučaj s anaerobnim mikroorganizmima.

Isto tako, ako se citokrom koji koristi mikroorganizam razlikuje od citokrom oksidaze c, također će dati negativan test.

Postupak

Postoje razni reagensi i protokoli za test oksidaze, a sve u istu svrhu.

Reagensi

Kovacsovi reagensi, Gordon i McLeod reagensi, Nadi reagensi, Carpenter, Suhrland i Morrison reagensi, te upotreba diskova oksidaze.

-Kovacs oksidazni reagens

Sastoji se od 1% tetrametil-p-fenilendiamin dihidroklorida.

Kovacsov reagens pripravlja se otapanjem 1 g gore navedene tvari u 50 ml destilirane vode. Grija se suptilno dok se potpuno ne otopi. Prebacite u ambernu bocu dovoljnog kapaciteta i dopunite volumen do 100 ml destiliranom vodom. Pričekajte najmanje 15 minuta prije upotrebe. Čuvati u hladnjaku zaštićenom od svjetlosti.

Označen je kovač-oksidaznim reagensom da bi se razlikovao od Kovacsovog reagensa koji se koristi za otkrivanje indolskog testa. Ovaj reagens je najosjetljiviji, manje toksičan, ali skuplji od ostalih reagensa.

Pozitivna reakcija pokazat će se s ovim reagensom, s promjenom boje kolonije u lavandu, koja brzo postaje ljubičasta gotovo crna. Negativna reakcija je evidentna jer u koloniji nema promjene boje ili poprima lagano ružičastu boju. Medij također može potamniti, ali to ne znači pozitivne reakcije.

S ovim reagensom vrijeme reakcije je presudno, promjena boje koja se dogodi između 5 do 15 sekundi smatra se pozitivnom reakcijom.

-Gordon i McLeod reagensi

Sastoji se od dimetil-p-fenilendiamin dihidroklorida, poznatog i kao N-dimetil-p-fenilendiamin ili p-aminodimetilanilin monohidroklorid. Priprema se kao što je opisano za reagens Kovacs oksidaze, zamjena za supstancu koja je uključena.

Ovaj reagens je nešto stabilniji od reagensa Kovacs oksidaze, iako su svi reagensi koji sadrže p-fenilendiamin nestabilni.

Ova reakcija je kasnije, ona se tumači kao pozitivna s pojavom plavo-ljubičaste boje unutar 10 do 30 minuta.

-Nadi reagens

Sastoji se od 1% α-naftola u etilnom alkoholu (95% etanola) i 1% aminodimetilanilina. Smjesa se priprema u jednakim dijelovima i upotrebljava se apsolutni etilni alkohol kao razrjeđivač, dok se ne stvori dovoljna količina za 100 ml.

-Carpenter, Suhrland i Morrison reagensi

Sastoji se od 1% p-aminodimetilalanin oksalata. Pripremite se na isti način kao što je opisano za Kovacs oksidazni reagens, mijenjajući za odgovarajuću tvar.

Sa pripremljenom otopinom, testne trake pripremaju se na sljedeći način: 6-8 cm trake filtarskog papira Whatman br. 1 impregniraju se s 1% -tnim dimetil-p-fenilendiamin oksalatnim reagensom.

Osušuju se bez kontakta s metalom, čuvaju u posudama s vijcima sa sušnim sredstvom i čuvaju u hladnjaku. Ove trake su stabilne do 6 mjeseci.

To je najstabilniji reagens od svih spomenutih, a u otopini može trajati i do 6 mjeseci. Još jedna plus točka je to što ne boji medij oko kolonije, ako se koristi izravno na ploči.

Pojava crvene boje tumači se kao pozitivan test.

-Oksidazni diskovi

Riječ je o komercijalnim diskovima koji su impregnirani reagensom za oksidazni test. Na tržištu postoji nekoliko komercijalnih marki.

Njegova je upotreba sasvim praktična, jer nije potrebno pripremiti svježe reagense, što olakšava rad. Dobiveni rezultati pouzdani su ako su diskovi pravilno sačuvani.

protokoli

Metoda izravne ploče, neizravna metoda na papiru i uporaba diskova impregniranih oksidaznim reagensima.

-Način direktne ploče

2 ili 3 kapi bilo kojeg od gore spomenutih reagensa dodaju se u tu svrhu izravno na koloniju (i) koja se nalazi u ploči s kulturom koja ne sadrži glukozu.

Promjena boje kolonija ili ne, tumači se, ne od medija. Važno vrijeme reakcije ovisi o korištenom reagensu.

- Neizravna metoda na papiru

Izrežite komad filtrirnog papira (Whatman br. 1) na veličinu od 6 cm ² i stavite ga u praznu Petrijevu posudu.

Dodajte 2 ili 3 kapi reagensa Kovacs oksidaze u papir, uzmite dio kolonije koju treba proučavati pomoću platinaste drške ili drvene čačkalice i raširite je ravnom linijom na papiru impregniranom reagensom. Tumačite u roku od 5 do 10 sekundi.

Sa trakama pripremljenim sa Carpenter, Suhrland i Morrison reagensom, kolonija se širi na suhu traku. Jedna traka koristi se za ispitivanje nekoliko sojeva. Tumačite u 10 sek.

-Diskovi (m

Suptilno namočite komercijalne diskove sterilnom destiliranom vodom i nanesite na koloniju koja će se proučavati. Preporučuje se upotreba ploča na 35 ° C, ako se koriste tanjuri na sobnoj temperaturi ili hladnjaci, reakcija je malo sporija. Tumačite promjenu boje između 10 i 20 sek.

Mogu se koristiti kolonije sadržane u krvi ili čokoladnom agaru.

-Diskovi (neizravna metoda)

Vlažite disk kao što je prethodno opisano. Stavite u praznu Petrijevu posudu. Uzmite dovoljnu količinu kolonije za proučavanje platinastom drškom ili drvenim čačkalicom i stavite na disk. Tumačite promjenu boje između 10 i 20 sek.

Koristiti

Rod Neisseria i Acinetobacter ponekad su morfološki vrlo slični jer iako je rod Acinetobacter gramo-negativni štap, ponekad može poprimiti kokoidni oblik i biti raspoređen u parovima, simulirajući rod Neisseria.

U ovom je slučaju test oksidaze zaista koristan. Rod Neisseria je pozitivan, a Acinetobacter negativan.

No, rod Moraxella vrlo je sličan rodu Neisseria i oboje daju pozitivnu reakciju; Zbog toga se uvijek moraju provesti testovi fermentacije ugljikohidrata za konačnu identifikaciju.

S druge strane, test oksidaze je koristan za razlikovanje bakterija koje pripadaju porodici Enterobacteriaceae (sve negativne oksidaze) od drugih fermenata, poput roda Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (pozitivna oksidaza).

Rodi Vibrio i Helicobacter također su pozitivni na oksidazu.

QA

Koristite poznate sojeve bakterije Escherichia coli kao negativnu kontrolu, a sojeve Pseudomonas aeruginosa kao pozitivnu kontrolu.

Ograničenja

-Ragensi se moraju koristiti svježe pripremljeni, njihov rok trajanja u otopini na sobnoj temperaturi je kratak, jer su vrlo nestabilni. U hladnjaku mogu trajati od 5 dana do 2 tjedna.

-Ragenti su bezbojni, ako promijene boju, moraju se odbaciti. Oštećeni diskovi se pojavljuju jer s vremenom potamne.

-Pozitivna reakcija s reagensom Kovacs oksidaze u razdoblju od 15 do 60 s smatra se odgođenom reakcijom, a nakon 60 sekundi treba je smatrati negativnom.

-Haemophylus influenzae daje negativnu reakciju oksidaze ako se koristi bilo koji reagens s dimetil-p-fenilendiaminom, ali pozitivnu ako se koristi reagens Kovacs oksidaze (tetrametil-p-fenilendiamin).

-Mediji koji sadrže glukozu ometaju test, dajući lažne negativnosti.

-Bordetella pertusis sojevi mogu dati lažno pozitivnu reakciju ako potječu iz visoko koncentriranih ploča s agarima krvi.

- Upotreba metalnih (željeznih) ručica daje lažno pozitivnu reakciju.

preporuke

-Budući da su reagensi vrlo nestabilni i imaju tendenciju samooksidiranja, preporučuje se zamrzavanje alikvota od 1 do 2 ml i uklanjanje prema potrebi.

-Drugi način za odlaganje autooksidacije reagensa je dodavanje 0,1% askorbinske kiseline prilikom pripreme reagensa.

-S obzirom da su reagensi nestabilni, preporučuje se tjedna kontrola kvalitete.

-Regenti koji ne prolaze test kontrole kvalitete ne smiju se koristiti.

Reference

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiološka dijagnoza. 12 ed. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
3. "Test oksidaze." Wikipedia, Slobodna enciklopedija. 15. siječnja 2018., 10.32 UTC. 3 tra 2019, 14:03
4. Svjetska zdravstvena organizacija. Laboratorijski priručnik za identifikaciju i ispitivanje osjetljivosti na antimikrobne bakterijske patogene od javnog značaja u svijetu u razvoju, 2004. Dostupno na: who.int/drugresistance/infosharing
5. Trake reagensa za dijagnozu oksidazne aktivnosti u bakterijama. Rev Kubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150-151.