- osnova
- priprema
- Prijave
- Sputum
- Ispiranje želuca, ispiranje bronha i bronhijalni aspirat
- Urin
- Ascites tekućina, pleuralna tekućina, cerebrospinalna tekućina
- Biopsija
- Larinalni bris
- sije
- inkubacija
- QA
- Ograničenja
- upućivanje
Medij Löwenstein-Jensen je selektivni čvrsti medij za izolaciju i razvoj bakterija roda Mycobacterium, poput Mycobacterium tuberculosis, M. avium, između ostalog, s izuzetkom vrste leprae, koja nije uzgojna.
Bakterije roda Mycobacterium ne rastu u konvencionalnim kulturama, stoga je bilo potrebno osmisliti poseban medij za njihovu izolaciju. Izvorni medij stvorio je Löwenstein, a kasnije ga je modificirao Jensen.
Löwenstein-Jensen medij s kolonijama Mycobacterium tuberculosis. Izvor: Agarwal i suradnici / BioMed Central Ltd., pod vodstvom Knjižnice Biology Image
Modifikacija se sastojala u uklanjanju crvenog boja u Kongu, zamjenjujući ga višom koncentracijom malahitne zelene boje. Također je izmijenio koncentracije magnezijevog citrata i monokalijevog fosfata.
Medij Löwenstein-Jensen trenutno sadrži škrob krumpira, asparagin, magnezijev citrat, monokalijev fosfat, magnezijev sulfat, malahit zeleno, nalidiksinsku kiselinu, cikloheksimid, linkomicin, tučena jaja, glicerin i vodu.
Mikobakterije se obično izoliraju s mjesta koja nisu sterilna, poput sputuma, urina, apscesa, između ostalog. To znači da će većina uzoraka sadržavati uobičajenu mikrobiotu tog područja, uz patogen.
Zato medij Löwenstein-Jensen sadrži niz inhibitora u svom sastavu koji su predstavljeni malahitnim zelenim, antibioticima i antifungalnim lijekovima.
Uz to, uzorci koji dolaze s nesterilnih mjesta moraju se dekontaminirati i neutralizirati prije sadnje u medij Löwenstein-Jensen.
osnova
Prisutnost jaja i glicerina u mediju Löwenstein-Jensen potiče rast mikobakterija jer one osiguravaju masne kiseline i proteine potrebne za razvoj tih mikroorganizama.
Medij Löwenstein-Jensen sadrži malahit zelenu boju, koja je inhibitor prateće mikrobiote. Ali on također sadrži nalidiksinsku kiselinu (35 µg / mL) koja inhibira Gram negativnu mikrobiotu, cikloheksimid (400 µg / mL), koji inhibira saprofitne gljivice i kvasce, te linkomicin (2 µ / mL), koji inhibira Gram pozitivnu mikrobiotu.
Neke trgovačke tvrtke radije dodaju sljedeću kombinaciju antibiotika: polimiksin B 200.000 jedinica / L, amfotericin B 10 mg / L, karbenicilin 50 mg / L i trimetoprim 10 mg / L.
Ovaj medij ne sadrži agar, pa dolazi do skrućivanja medija zbog koagulacije albumina koji je prisutan u jajetu tijekom sterilizacije.
priprema
U 600 ml destilirane vode odmjeri se 37,3 g dehidriranog medija kojem je prethodno dodano 12 ml glicerola. Smjesa se zagrijava, često miješajući dok se potpuno ne otopi. Autoklavirajte medij na 121 ° C 15 minuta.
S druge strane, u aseptičnim uvjetima treba pripremiti homogenu suspenziju od 1000 ml svježih jaja. Dodajte suspenziju jaja u 600 ml medija pripremljenog na temperaturi 50 - 60 ° C, izbjegavajući mjehuriće zraka.
Nakon sterilizacije u autoklavu se dodaju i antibiotičke otopine.
Ulijte medij u sterilne epruvete s poklopcem. Zagrijte epruvete na 85 ° C 45 minuta u nagnutom položaju.
Boja pripremljenog medija je akvamarin zelena i može stvoriti bjelkaste mrlje zbog prisustva lipida u jajima.
PH sredstva mora biti 7,2 ± 0,2
Spremite epruvete u hladnjak i zaštićene od izravnog svjetla do upotrebe. Temper prije sjetve.
Postoji modifikacija medija pod nazivom „Gruft modifikacija Löwenstein Jensena“. Sadrži iste spojeve kao i klasični medij, ali dodaje se RNA-5mg / 100 mL, a kao inhibitori sadrži malahit zeleno 0,025 g / 100 mL, penicilin 50 U / mL i nalidiksičnu kiselinu 35 ug / mL.
Prijave
Medij Löwenstein-Jensen koristi se za izolaciju mikobakterija iz različitih vrsta uzoraka. Boja od Ziehl-Neelsena preporučuje se za svaki uzorak u kojem se sumnja na prisutnost mikobakterija.
Neki uzorci dolaze sa sterilnih lokacija, a drugi ne. Nesterilni uzorci moraju se po potrebi dekontaminirati:
Sputum
Uzorke sputuma treba dekontaminirati na sljedeći način: odrediti količinu uzorka ispljuvaka u ml i dodati istu količinu 4% NaOH u uzorak i inkubirati na 37 ° C.
Brzo protresite smjesu u roku od 30 minuta. Nakon toga centrifugirajte na 3000 RPM tijekom 30 minuta.
Odbacite supernatant preko fenolne otopine dezinficijensa. Za sjetvu koristite sediment, ali najprije pH mora biti neutraliziran.
Neutralizirati sediment, 5% H 2 SO 4 koristi se u prisutnosti fenola bez crvenog indikatora dok se ne dostigne neutralni pH koji uzrokuje boje lososa.
Ispiranje želuca, ispiranje bronha i bronhijalni aspirat
U tom se slučaju uzorak mora centrifugirati na 3000 RPM tijekom 30 minuta. Supernatant se odbacuje i pelet se koristi. Za dekontaminiranje sedimenata dodajte 3 ml 4% NaOH i često miješajte na 37 ° C tijekom pola sata.
Ponovno centrifugiranje, supernatant se odbacuje i pelet se koristi. Potonji se moraju neutralizirati kako je objašnjeno u uzorku sputuma.
Urin
Ostavite uzorak da se slegne u hladnjaku 24 sata. Odvojite supernatant. Preostali pelet treba centrifugirati 30 minuta na 3000 RMP. Ponovno odbacite supernatant i otopite pelet s 3 ml sterilne fiziološke otopine.
Dodajte 3 ml 4% NaOH i nastavite sa dekontaminacijom i neutralizacijom kako je prethodno opisano.
Ascites tekućina, pleuralna tekućina, cerebrospinalna tekućina
U ovoj vrsti uzorka se centrifugira, a supernatant se odbaci. Izvedite Gram na sedimentu ili promatrajte direktno pod mikroskopom; Ako se ne primijete bakterije, nije neophodan korak dekontaminacije, niti je korak neutralizacije.
U ovom slučaju uzorak se može sijati izravno pomoću sedimenta. Ako postoje bakterije, nastavite s dekontaminacijom i neutralizirajte kako je gore opisano.
Biopsija
Ovom tipu uzorka treba dodati 5 ml destilirane vode, da bi se kasnije centrifugiralo na 1500 okretaja u minuti tijekom 10 minuta. Odbacite supernatant i ponovno centrifugirajte talog pri 3500 okr / min tijekom 30 minuta. Koristite sediment za sijanje kulture kulture.
Larinalni bris
Bris se treba staviti u sterilnu epruvetu koja sadrži jednake dijelove destilirane vode i 4% NaOH. Bris se mora pritisnuti na stijenke cijevi, tako da se uzorak razrijedi u tekućini. Centrifugirajte i koristite talog. Neutralizirajte sediment kao što je već opisano.
sije
Medij Löwenstein-Jensen inokulira se dodavanjem 0,5 ml uzorka na površinu medija. Zakrenite epruvetu za raspodjelu uzorka po mediju. Ne koristite platinastu ručku.
Može se sijati druga cijev koja sadrži Stonebrink medijum kako bi se izolirala Mycobacterium bovis i druge vrste koje ne rastu na mediju Löwenstein-Jensen.
inkubacija
Inokulirane epruvete inkubiraju se aerobno na 37 ° C, a poklopac je malo labav i nagnut na približno 5 ° i zaštićen od svjetlosti. Okoliš se može obogatiti s 5–10% ugljičnog dioksida. Dvaput tjedno provjeravajte kulture dok se ne pojave kolonije.
Kad se uzorak apsorbira, kapice se stežu. Maksimalno vrijeme inkubacije je 8 tjedana, ako nakon tog vremena ne dođe do rasta, prijavljeno je kao negativno.
QA
Sljedeći sojevi se mogu koristiti kao kontrola kvalitete:
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogec 320 320 Atccoc, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATCC6, ATKO, ATCC6, ATCC 27, 32
Za prve tri navedene vrste očekuje se izvrstan razvoj, za M. fortuitum rast bi trebao biti dobar, dok je za M. bovis mali ili nikakav rast. U međuvremenu, vrste osim roda Mycobacterium moraju se u potpunosti inhibirati.
Ograničenja
Pripremljeni medij mora biti zaštićen od svjetlosti, dugotrajno izlaganje svjetlu uzrokuje da se medij pretvori iz zelene u plavu, a u tom slučaju medij se više ne može koristiti. To je zato što je malahitno zeleno fotoosjetljivo.
Medij, jer sadrži jaja, može se lako kontaminirati ako se s njim ne postupa aseptično. Može se otopiti ako postane kontaminirana proteolitičkim bakterijama.
Uzgoj i rukovanje bakterijama roda Mycobacterium zahtijeva kvalificirano osoblje koje je svjesno mjera biološke sigurnosti koje se moraju poštivati kako ne bi došlo do kontaminacije ili onečišćenja drugih.
HCl se ne smije koristiti u koraku neutralizacije zbog stvaranja natrijevog klorida, koji može biti toksičan za Kochov bacil.
Uzorci treba držati u hladnjaku i zaštititi ih od svjetlosti, a da se pri njima ne obrađuju.
upućivanje
- Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. Selektivni medij Löwenstein-Jensen. Dostupno na: f-soria.es
- Britannia Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen medij. Dostupno na: britanialab.com.
- Neogeni laboratoriji. Medij Löwenstein-Jensen. Dostupno na: foodsafety.neogen.com.
- "Medij Löwenstein-Jensen." Wikipedia, Slobodna enciklopedija. 20.11.2018., 15:15 UTC. 24. travnja 2019., 18:34. wikipedia.org
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. 5. izd. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiološka dijagnoza. 12 ed. Uredništvo Panamericana SA Argentina.
- Mac Faddin J. (2003). Biokemijski testovi za identifikaciju bakterija kliničkog značaja. 3. izd. Uredništvo Panamericana. Buenos Aires. Argentina.