DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-FENILINDOL): KARAKTERISTIKE, OBRAZLOŽENJE, UPORABA - KEMIJA - 2025

DAPI (4”, 6-diamidino-2-fenilindol) je boja iz fluorescentnog objektu služi kao jedan marker, široko se koriste u struci za fluorescentnu mikroskopiju ili protočnom citometrijom, među ostalima. Fluorescencija koju emitira svijetlo je plava boja, njezino uzbuđenje se događa između 455-461 nm (UV svjetlost).

DAPI boja može s velikom lakoćom proći kroz staničnu membranu mrtvih stanica. Također može obojati jezgre živih stanica, ali u ovom slučaju koncentracija toga mora biti veća.

Kemijska struktura fluorescentnog bojila DAPI. Izvor: Slika: Datoteka: DAPI.svg je vektorska verzija ove datoteke. Trebalo bi ga koristiti umjesto ove rasterske slike kada nije inferiorniji / Richard Wheeler (Zephyris) Uređena slika

Boja je sposobna pristupiti staničnoj DNK za koju ima poseban afinitet, s velikom strašću vezuje se za dušične baze adenin i timin. Iz tog razloga je vrlo korisna u nekim tehnikama molekularne biologije.

Ovaj spoj pripada skupini indoloških boja, a dokazano je da ima veću osjetljivost na DNK od etidijum bromida i propidijum jodida, posebno na agarozne gelove.

Upotreba ove fluorescentne boje vrlo je široka, jer je korisna za: proučavanje promjena u DNA u apoptotskim procesima (stanična smrt) i stoga otkrivanje stanica u ovom procesu; za DNA otisak fotografija (DNK ispis fotografija); proučavati bakterijsku kontaminaciju; ili za vizualizaciju nuklearne segmentacije.

Korištena je i u istraživanju kromosomskih vrpci, u otkrivanju Mycoplasmas sp DNA, u interakciji DNA-protein, u bojenju i prebrojavanju stanica imunofluorescencijom, pa čak i u obojenju zrelih peludnih zrnaca.

karakteristike

DAPI je kratica njegovog kemijskog naziva (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). Njegova molekularna formula je C ₁₆ H ₁₅ N _5. Molekulska masa je 350,3. U blizini raspona UV svjetla (345 do 358 nm) dolazi do najvećeg uzbuđenja kompleksa DAPI-DNA, dok se maksimalna emisija fluorescencije događa između 455-461 nm.

Ova je boja okarakterizirana kao žuti prah, ali strukture označene ovim fluoroforom emitiraju sjajno plavu svjetlost.

Radi se o spoju topivom u vodi, ali kako bi se ubrzalo otapanje može se primijeniti određena toplina. Može se razrijediti s PBS-om, ali ne direktno otopiti u njemu.

Nakon što se boja pripremi, mora se čuvati u mraku, odnosno zaštićeno od svjetlosti, na temperaturi od 2 do 8 ° C (hladnjak). U tim uvjetima, boja je postojana više od 3 tjedna ili mjeseca.

Ako je zaštićen od svjetlosti, ali ostavljen na sobnoj temperaturi, njegova stabilnost opada na 2 ili 3 tjedna, ali izložena izravnom svjetlu, propadanje je vrlo brzo. Ako želite čuvati mnogo duže, može se hladiti na -20 ° C, raspodijeljeno u alikvotima.

osnova

Bojenje se temelji na stvaranju nuklearnog kontrasta u glavnim tehnikama molekularne biologije, kao što su: protočna citometrija, fluorescentna mikroskopija i bojenje metafaznih kromosoma ili interfaznih jezgara.

Ova se tehnika temelji na velikom afinitetu boje koji ima dušične baze (adenin i timin) sadržane u genetskom materijalu (DNK) u utoru. Na citoplazmatskoj razini ostavlja vrlo malo pozadine.

Kada se fluorescentna boja veže na adeninsku i timinsku regiju DNA, fluorescencija se značajno povećava (20 puta više). Boja koju emitira je svijetloplava. Značajno je da ne postoji emisija fluorescencije kada se veže na GC (gvanin-citozin) parove baza.

Važno je napomenuti da iako ima afinitet prema RNA, to ne uzrokuje probleme, jer se najveći stupanj emisije energije iz te molekule događa na drugoj valnoj duljini (500 nm), za razliku od DNK, što to čini pri 460 nm. Nadalje, porast fluorescencije jednom vezane na RNA iznosi samo 20%.

DAPI se koristi više za obojenje mrtvih (fiksnih) stanica nego živih stanica, jer je za obojenje ovih potonji potrebna mnogo veća koncentracija boje, to je zato što je stanična membrana mnogo manje propusna za DAPI kad je živa.

DAPI boja može se koristiti u kombinaciji s crvenim i zelenim fluoroforima za višebojni doživljaj.

Koristiti

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) izvrstan je fluorofor i zbog toga se široko koristi u različitim tehnikama i u različite svrhe. Sljedeće objašnjava uporabu DAPI-ja u glavnim tehnikama.

Protok citometrije

Istraživači Gohde, Schumann i Zante 1978. prvi su koristili i predložili DAPI kao fluorofor u tehnici protočne citometrije, postižući veliki uspjeh zbog visoke osjetljivosti na DNK i velikog intenziteta u emisiji fluorescencije.

Upotreba DAPI u ovoj tehnici omogućuje proučavanje staničnog ciklusa, kvantifikaciju stanica i bojenje živih i mrtvih stanica.

Iako postoje i druga bojila, poput etidij-bromida, Hoechst-ovog oksida, akridin naranče i propidijevog jodida, DAPI je jedan od najčešće korištenih jer je fotostabilniji od prethodno spomenutih.

Za ovu tehniku ​​potrebno je popraviti stanice, za to se može koristiti apsolutni etanol ili 4% paraformaldehid. Uzorak se centrifugira i supernatant se odbaci, nakon čega se stanice hidriraju dodavanjem 5 ml PBS pufera tokom 15 minuta.

Dok vrijeme prolazi, pripremite DAPI mrlju s puferom za bojenje (FOXP3 od BioLegend) u koncentraciji od 3 uM.

Centrifugirajte uzorak, odbacite supernatant i zatim prekrijte 1 ml otopine DAPI 15 minuta na sobnoj temperaturi.

Uzorak odnesite u protočni citometar odgovarajućim laserom.

Protok mikrofluorometrija

Druga tehnika u kojoj se koristi DAPI je protočna mikro fluorometrija zajedno s drugim fluoroforom nazvanim mitramicin. Obje su korisne za pojedinačno kvantificiranje DNK kloroplasta, ali DAPI je najprikladniji za mjerenje T4 čestica bakteriofaga.

Hibridizacija

Ova se tehnika u osnovi koristi DNA sondama označenim fluorescentnim bojama koje mogu biti DAPI.

Uzorak zahtijeva toplinsku obradu za denaturaciju dvolančane DNK i pretvaranje u dva jednolančana lanca. Nakon toga se hibridizira s DAPI denaturiranom DNA sondom koja ima slijed interesa.

Kasnije se ispere kako bi se uklonilo ono što nije hibridizirano, koristi se kontrast za vizualizaciju DNK. Fluorescentni mikroskop omogućuje promatranje hibridizirane sonde.

Ova tehnika ima za svrhu otkrivanje specifičnih sekvenci u kromosomskoj DNK, radi postavljanja dijagnoze određenih bolesti.

Ove cito-molekularne tehnike bile su od velike pomoći u određivanju detalja u istraživanju kariotipa. Na primjer, pokazao je regije adenozina i timina bogata baznim parovima nazvane heterokromatske regije ili DAPI pojasevi.

Ova se tehnika široko koristi za proučavanje kromosoma i kromatina kod biljaka i životinja, kao i za dijagnozu prenatalnih i hematoloških patologija kod ljudi.

U ovoj tehnici, preporučena koncentracija DAPI iznosi 150 ng / ml u vremenu od 15 minuta.

Sklopljeni tobogani trebaju se čuvati zaštićeni od svjetlosti na 2-8 ° C.

Imunofluorescentno bojenje

Stanice su fiksirane s 4% paraformaldehida. Ako se trebaju koristiti druge mrlje, DAPI se na kraju ostavlja kao kontrasta, a stanice se prekrivaju otopinom PBS-a 15 minuta. Dok vrijeme prolazi, pripremite otopinu DAPI razrjeđivanjem s PBS-om, tako da konačna koncentracija iznosi 300 uM.

Tada se višak PBS-a ukloni i prekriva DAPI 5 minuta. Prati nekoliko puta. Klizač se pregledava pod fluorescentnim mikroskopom pod odgovarajućim filterom.

Sigurnosni list

S ovim spojem se mora postupati pažljivo, jer je spoj koji ima mutagena svojstva. Aktivni ugljen koristi se za uklanjanje ovog spoja iz vodenih otopina koje se moraju odbaciti.

Rukavice, haljina i zaštitne naočale moraju se koristiti da se izbjegne nezgoda s ovim reagensom. Ako dođe do kontakta s kožom ili sluznicom, područje treba isprati s dovoljno vode.

Nikada ne smijete pipetirati ovaj reagent usta, koristite pipete.

Ne kontaminirajte reagens mikrobnim agensima jer će to dovesti do pogrešnih rezultata.

Nemojte razrjeđivati ​​DAPI mrlju više nego što je preporučeno, jer će to značajno smanjiti kvalitetu mrlje.

Nemojte izlagati reagens direktnom svjetlu ili držati toplo jer to smanjuje fluorescenciju.

Reference

1. Brammer S, Toniazzo C i Poersch L. Corantes najčešće uključeni u biljnu citogenetiku. Ark., Inst. Biol. 2015, 82. Dostupno od: scielo.
2. Impath Laboratories. DAPI. Dostupno na: menarinidiagnostics.com/
3. Cytocell Laboratories. 2019. Upute za uporabu DAPI. dostupno na cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Pojmovi i tehnike u riječnoj ekologiji. (2009). Uredništvo Rubes, Španjolska. Dostupno na: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Uporaba fluorescencije u modificiranoj disektorskoj metodi za procjenu broja miocita u srčanom tkivu. Arch Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Dostupno od: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Prisutnost fitoplazmi u papaji (Carica papaya) u Meksiku. Časopis Chapingo. Serija o hortikulturi, 2011.; 17 (1), 47-50. Dostupno na: scielo.org.